Her beskriver vi en hydroponic plantevekst analysen å kvantifisere arter tilstedeværelse og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter deres overføring til ulike vekst miljøer.
Bakterier danner komplekse rhizosphere microbiomes formet av samspill mikrober, større organismer, og abiotiske miljøet. Under laboratorieforhold, rhizosphere kolonisering av plantevekst-fremme bakterier (PGPB) kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg i forhold til uncolonized planter. Men i feltet innstillinger, bakteriell behandlinger med PGPB ofte ikke gir betydelige fordeler til avlinger. En forklaring er at dette kan skyldes tap av PGPB under interaksjoner med endogene Jord mikrober over levetiden til anlegget. Denne muligheten har vært vanskelig å bekrefte, siden de fleste studier fokus på den første kolonisering snarere enn vedlikehold av PGPB innen rhizosphere samfunn. Det er hypotetisk gjennomsnitt her at forsamlingen, sameksistens, og vedlikehold av bakterielle samfunn er formet av deterministisk funksjoner i rhizosphere mikromiljøet, og at disse interaksjoner kan påvirke PGPB overlevelse i native Settings. Å studere disse atferd, en hydroponic plante-vekst analysen er optimalisert ved hjelp Arabidopsis thaliana å kvantifisere og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter overføring til annen vekst Miljøer. Dette systemets reproduserbarhet og nytte blir deretter validert med godt studert PGPB Pseudomonas simiae. For å undersøke hvordan tilstedeværelsen av flere bakterielle arter kan påvirke kolonisering og vedlikehold dynamikk på anlegget roten, en modell samfunn fra tre bakterielle stammer (en Arthrobacter, Curtobacterium, og Microbacterium arter) som opprinnelig ble isolert fra A. thaliana rhizosphere er konstruert. Det er vist at tilstedeværelsen av disse ulike bakterielle arter kan måles ved hjelp av denne hydroponic plante-vedlikehold analysen, som gir et alternativ til sekvensering-baserte bakterielle samfunnet studier. Fremtidige studier ved hjelp av dette systemet kan forbedre forståelsen av bakteriell atferd i multispecies anlegget microbiomes over tid og i skiftende miljøforhold.
Crop ødeleggelse av bakterielle og Fungal sykdommer resulterer i senket matproduksjon og kan sterkt forstyrre global stabilitet1. Basert på oppdagelsen av at mikrober i undertrykkende jordsmonn er ansvarlig for å øke plante helse2, har forskere spurt om anlegget mikrobiomet kan utnyttes til å støtte plantevekst ved å endre tilstedeværelsen og overflod av spesielle bakteriearter3. Bakterier funnet å hjelpe i plantevekst eller utvikling er kollektivt betegnet plantevekst-fremme bakterier (PGPB). Flere nylig har studier forskjøvet fra bare identifisere potensielle PGPB å forstå hvordan interkingdom interaksjoner i jorda, rundt røtter, eller i rhizosphere (området direkte rundt og med roten overflaten) kan påvirke PGPB aktivitet4.
Rhizosphere kolonisering av PGPB kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg som svar på ulike stressfaktorer i forhold til uncolonized planter5. Men resultatene er ofte mer variabel i native jord forhold sammenlignet med de som er observert i de nøye kontrollerte drivhus og laboratorie innstillinger6. En hypotese for denne forskjellen er at veksten eller atferden til PGPB kan være hemmet av innfødte jord bakterier eller sopp i feltene7,8. Gunstige effekter av rhizosphere bakterier generelt avhenge av evnen til bakterier til 1) finne og bevege seg mot roten, 2) kolonisere roten gjennom biofilm formasjon, og 3) samhandle med verten plante eller patogener via produksjon av små molekyl metabolitter7,9. Noen av disse kolonisering atferd kan påvirkes av tilstedeværelsen og aktiviteten til nærliggende mikrober10.
Vi utviklet et system for å kvantifisere og visualisere disse distinkte bakteriell kolonisering stadier av rhizosphere (figur 1). Denne tilnærmingen vil lette studier undersøker hvorfor langsiktige PGPB vedlikehold er noen ganger ikke observert etter overføring av planter i nye miljøer, for eksempel under planting av pre-inokulert frøplanter. Arabidopsis thaliana AS ble valgt som en plante modell på grunn av sin omfattende bruk i laboratoriestudier, samt rikelig data tilgjengelig om sin mikrobielle interaksjoner11. Det er tre stadier i systemet: 1) A. thaliana vekst, 2) bakteriell kolonisering og 3) bakteriell vedlikehold (se figur 1). Fordi A. thaliana er en bakkenett plante, var det viktig å sikre at det ikke var lider unødig vann stress i hydroponic system12. Inspirert av metodene som brukes av Haney et al.13, er frøplanter dyrket på plast Mesh for å skille skyte fra væsken vekstmedium. Dette systemet ser ikke ut til å kompromittere helsen og utviklingen av anlegget vert, og det forbedrer A. thaliana vekst i flytende11. Som anlegget skyter flyter over overflaten, røttene er fullt eksponert for kolonisering av bakterier inokulert inn i væsken bakteriell vekstmedium. Dette tillater bakterier av interesse å bli undersøkt for kolonisering i næringsstoffer som er mest bidrar til vekst, samtidig som skiftende forhold slik at anlegget til å fortsette å vokse i et nærings medium utviklet for å støtte sin vekst. Begge stadier inkluderer jevn risting for å hindre Anoxia av roten13. Bakterier kan visualisere eller kvantifisert fra planterøttene etter overføring fra enten kolonisering medium eller vedlikehold medium. Dette hydroponic systemet er svært fleksibelt, slik at eksperimentelle forhold og anvendt påkjenninger for å være lett endres avhengig av interessene til forskerne.
Denne beskrevne metoden er viktig i sammenheng med den større kroppen av litteratur om plante-mikrobe interaksjoner fordi det gir et robust system for å studere disse interaksjoner på roten overflaten samtidig som tilpasses til vekst preferanser av forskjellige bakterier. Plant biologi laboratorier ofte utføre plante-mikrobe kolonisering eksperimenter på solid agar, slik at for bare Planar bevegelse (hvis det) av bakterier samtidig krever potensielt ødeleggende manipulering av planter under påfølgende overføring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofte prioritert helsen til bakteriene i sine eksperimenter, til skade for plantene14,15. Disse ulike prioriteringer av plante-og mikrobiologi-fokuserte laboratorier har historisk gjort det vanskelig å sammenligne resultatene mellom disse gruppene, siden hver typisk optimaliserer eksperimentelle forhold for å optimalisere sin organisme av interesse15. Den flytende-mesh-plante-vekst system beskrevet her hindrer full plante nedsenking, en betydelig fordel for tidligere mikrobiologi-orienterte studier, samtidig som midlertidig optimalisere vekst og overlevelse av bakterier for å lette kolonisering. Dermed analysen vi presenterer her kan adressen bekymringer fra både plante biologer (om over-hydration og taktil manipulasjon av anlegget), mens tilfredsstiller kriteriene for mikrobiologer (som tillater ulike bakterielle vekstforhold og flere Arts interaksjoner)7. Denne protokollen er utformet for å kunne tilpasses for bruk med ulike bakterier, planter og miljøforhold.
Planter i alle miljøer samhandle med tusener til millioner av forskjellige bakterier og sopp5,7. Disse interaksjoner kan enten negativt og positivt påvirke plante helse, med potensielle effekter på avling yield og matproduksjon. Nyere arbeid tyder også på at variabel kolonisering av avlinger av PGPBs kan gjøre rede for uforutsigbare plante størrelse og beskjære yield i feltet prøvelser22. Forstå mekanismene bak disse interaksjone…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler levert av Department of Energy biologiske og miljømessige forskning (DOE-BER 0000217519 til E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 til E. A. S). SLH ble også støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program. Vi takker Dr. Jeffery Dangl for å gi bakterielle stammer og uvurderlig innsikt. Vi takker Dr. Andrew Klein og Matthew J. Powers for eksperimentelle forslag. Til slutt, SLH ønsker å takke tilkoblinger på sosiale medier for påminner oss om at formidling av vitenskap er et privilegium og et ansvar, spesielt gjennom kreative og tilgjengelige midler.
Required Materials | |||
1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
Autoclave | any | N/A | |
Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
bleach | any | N/A | |
Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
Ethanol | any | N/A | |
Flame | any | N/A | |
Forceps | any | N/A | |
Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
Hydrochloric Acid | any | N/A | |
Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
Microcentrifuge | any | N/A | |
Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
Reservoirs | any | N/A | |
Spectrophotometer | any | N/A | |
Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
Sterile water | any | N/A | |
Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
Ultrasonicator | any | N/A | |
Vortex Mixer | any | N/A | |
X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
Suggested Materials | |||
24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
Glass beads | any | N/A | |
Multipetter/Repetter | any | N/A | |
Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
Biological Materials Used | |||
Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |