Overvåking bakteriell kolonisering og vedlikehold på Arabidopsis thaliana røtter i en flytende hydroponic system

Summary

Her beskriver vi en hydroponic plantevekst analysen å kvantifisere arter tilstedeværelse og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter deres overføring til ulike vekst miljøer.

Abstract

Bakterier danner komplekse rhizosphere microbiomes formet av samspill mikrober, større organismer, og abiotiske miljøet. Under laboratorieforhold, rhizosphere kolonisering av plantevekst-fremme bakterier (PGPB) kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg i forhold til uncolonized planter. Men i feltet innstillinger, bakteriell behandlinger med PGPB ofte ikke gir betydelige fordeler til avlinger. En forklaring er at dette kan skyldes tap av PGPB under interaksjoner med endogene Jord mikrober over levetiden til anlegget. Denne muligheten har vært vanskelig å bekrefte, siden de fleste studier fokus på den første kolonisering snarere enn vedlikehold av PGPB innen rhizosphere samfunn. Det er hypotetisk gjennomsnitt her at forsamlingen, sameksistens, og vedlikehold av bakterielle samfunn er formet av deterministisk funksjoner i rhizosphere mikromiljøet, og at disse interaksjoner kan påvirke PGPB overlevelse i native Settings. Å studere disse atferd, en hydroponic plante-vekst analysen er optimalisert ved hjelp Arabidopsis thaliana å kvantifisere og visualisere den romlige fordelingen av bakterier under første kolonisering av planterøtter og etter overføring til annen vekst Miljøer. Dette systemets reproduserbarhet og nytte blir deretter validert med godt studert PGPB Pseudomonas simiae. For å undersøke hvordan tilstedeværelsen av flere bakterielle arter kan påvirke kolonisering og vedlikehold dynamikk på anlegget roten, en modell samfunn fra tre bakterielle stammer (en Arthrobacter, Curtobacterium, og Microbacterium arter) som opprinnelig ble isolert fra A. thaliana rhizosphere er konstruert. Det er vist at tilstedeværelsen av disse ulike bakterielle arter kan måles ved hjelp av denne hydroponic plante-vedlikehold analysen, som gir et alternativ til sekvensering-baserte bakterielle samfunnet studier. Fremtidige studier ved hjelp av dette systemet kan forbedre forståelsen av bakteriell atferd i multispecies anlegget microbiomes over tid og i skiftende miljøforhold.

Introduction

Crop ødeleggelse av bakterielle og Fungal sykdommer resulterer i senket matproduksjon og kan sterkt forstyrre global stabilitet¹. Basert på oppdagelsen av at mikrober i undertrykkende jordsmonn er ansvarlig for å øke plante helse², har forskere spurt om anlegget mikrobiomet kan utnyttes til å støtte plantevekst ved å endre tilstedeværelsen og overflod av spesielle bakteriearter³. Bakterier funnet å hjelpe i plantevekst eller utvikling er kollektivt betegnet plantevekst-fremme bakterier (PGPB). Flere nylig har studier forskjøvet fra bare identifisere potensielle PGPB å forstå hvordan interkingdom interaksjoner i jorda, rundt røtter, eller i rhizosphere (området direkte rundt og med roten overflaten) kan påvirke PGPB aktivitet⁴.

Rhizosphere kolonisering av PGPB kan øke helsen eller utviklingen av verts anlegg som svar på ulike stressfaktorer i forhold til uncolonized planter⁵. Men resultatene er ofte mer variabel i native jord forhold sammenlignet med de som er observert i de nøye kontrollerte drivhus og laboratorie innstillinger⁶. En hypotese for denne forskjellen er at veksten eller atferden til PGPB kan være hemmet av innfødte jord bakterier eller sopp i feltene^7,8. Gunstige effekter av rhizosphere bakterier generelt avhenge av evnen til bakterier til 1) finne og bevege seg mot roten, 2) kolonisere roten gjennom biofilm formasjon, og 3) samhandle med verten plante eller patogener via produksjon av små molekyl metabolitter^7,9. Noen av disse kolonisering atferd kan påvirkes av tilstedeværelsen og aktiviteten til nærliggende mikrober¹⁰.

Vi utviklet et system for å kvantifisere og visualisere disse distinkte bakteriell kolonisering stadier av rhizosphere (figur 1). Denne tilnærmingen vil lette studier undersøker hvorfor langsiktige PGPB vedlikehold er noen ganger ikke observert etter overføring av planter i nye miljøer, for eksempel under planting av pre-inokulert frøplanter. Arabidopsis thaliana AS ble valgt som en plante modell på grunn av sin omfattende bruk i laboratoriestudier, samt rikelig data tilgjengelig om sin mikrobielle interaksjoner¹¹. Det er tre stadier i systemet: 1) A. thaliana vekst, 2) bakteriell kolonisering og 3) bakteriell vedlikehold (se figur 1). Fordi A. thaliana er en bakkenett plante, var det viktig å sikre at det ikke var lider unødig vann stress i hydroponic system¹². Inspirert av metodene som brukes av Haney et al.¹³, er frøplanter dyrket på plast Mesh for å skille skyte fra væsken vekstmedium. Dette systemet ser ikke ut til å kompromittere helsen og utviklingen av anlegget vert, og det forbedrer A. thaliana vekst i flytende¹¹. Som anlegget skyter flyter over overflaten, røttene er fullt eksponert for kolonisering av bakterier inokulert inn i væsken bakteriell vekstmedium. Dette tillater bakterier av interesse å bli undersøkt for kolonisering i næringsstoffer som er mest bidrar til vekst, samtidig som skiftende forhold slik at anlegget til å fortsette å vokse i et nærings medium utviklet for å støtte sin vekst. Begge stadier inkluderer jevn risting for å hindre Anoxia av roten¹³. Bakterier kan visualisere eller kvantifisert fra planterøttene etter overføring fra enten kolonisering medium eller vedlikehold medium. Dette hydroponic systemet er svært fleksibelt, slik at eksperimentelle forhold og anvendt påkjenninger for å være lett endres avhengig av interessene til forskerne.

Denne beskrevne metoden er viktig i sammenheng med den større kroppen av litteratur om plante-mikrobe interaksjoner fordi det gir et robust system for å studere disse interaksjoner på roten overflaten samtidig som tilpasses til vekst preferanser av forskjellige bakterier. Plant biologi laboratorier ofte utføre plante-mikrobe kolonisering eksperimenter på solid agar, slik at for bare Planar bevegelse (hvis det) av bakterier samtidig krever potensielt ødeleggende manipulering av planter under påfølgende overføring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofte prioritert helsen til bakteriene i sine eksperimenter, til skade for plantene^14,15. Disse ulike prioriteringer av plante-og mikrobiologi-fokuserte laboratorier har historisk gjort det vanskelig å sammenligne resultatene mellom disse gruppene, siden hver typisk optimaliserer eksperimentelle forhold for å optimalisere sin organisme av interesse¹⁵. Den flytende-mesh-plante-vekst system beskrevet her hindrer full plante nedsenking, en betydelig fordel for tidligere mikrobiologi-orienterte studier, samtidig som midlertidig optimalisere vekst og overlevelse av bakterier for å lette kolonisering. Dermed analysen vi presenterer her kan adressen bekymringer fra både plante biologer (om over-hydration og taktil manipulasjon av anlegget), mens tilfredsstiller kriteriene for mikrobiologer (som tillater ulike bakterielle vekstforhold og flere Arts interaksjoner)⁷. Denne protokollen er utformet for å kunne tilpasses for bruk med ulike bakterier, planter og miljøforhold.

Protocol

Merk: det eksperimentelle oppsettet er beskrevet for klarhet og brukes til å generere representative resultater inkludert i denne rapporten, men forholdene kan endres etter ønske. Alle trinn bør utføres ved hjelp av PPE og følgende institusjonelle og føderale varmeste for sikkerhet, i henhold til BSL status for bakteriene som brukes. 1. karakterisering av bakterier Bestem morfologi av bakterier på veksten medium agar plate. Resuspend celler på en omtrentlig OD600 =…

Representative Results

Den godt preget PGPB P. simiae WCS417r er kjent for å kolonisere røttene av A. thaliana i hydroponic kultur. Dette naturlig fluorescerende bakterien kan lett bli visualisere ved hjelp av mikroskopi på røttene av frøplanter etter kolonisering (figur 2). Selv om det er mulig å avbilde hele lengden av disse A. thaliana frøplanter ‘ (4-6 mm lengde) røtter, gjør det for mange planter ville ta en uoverkommelige tid. Fordi de fles…

Discussion

Planter i alle miljøer samhandle med tusener til millioner av forskjellige bakterier og sopp^5,7. Disse interaksjoner kan enten negativt og positivt påvirke plante helse, med potensielle effekter på avling yield og matproduksjon. Nyere arbeid tyder også på at variabel kolonisering av avlinger av PGPBs kan gjøre rede for uforutsigbare plante størrelse og beskjære yield i feltet prøvelser²². Forstå mekanismene bak disse interaksjone…

Materials

Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017