Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en fritt flytande indirekta immunofluorescens assay på huden biopsi sektioner som gör det möjligt att identifiera sjukdomsspecifika kon formation varianter av alfa-Synuclein inblandade i Parkinsons sjukdom och flera proteiner i perifera nerv systemet.
Abstract
Hittills, för de flesta neurodegenerativa sjukdomar endast en obduktion histopatologisk definitiv diagnos är tillgänglig. För Parkinsons sjukdom (PD), diagnosen fortfarande förlitar sig endast på kliniska tecken på motorisk inblandning som visas senare i sjukdomsförloppet, när de flesta av dopaminerga nerv celler är redan förlorat. Därför finns det ett starkt behov av en bio markör som kan identifiera patienter i början av sjukdomen eller med risk att utveckla den. Under de senaste åren har hudbiopsi visat sig vara en utmärkt forskning och diagnostiska verktyg för perifera nerv sjukdomar såsom små fiber neuropati. Intressant, en liten fiber neuropati och alpha Synuclein (αSyn) neurala insättningar har visats av hudbiopsi hos PD-patienter. I själva verket har hudbiopsi den stora fördelen av att vara en lättillgänglig, minimalt invasiva och smärtfri förfarande som gör det möjligt att analysera perifera nervvävnad benägna att patologin. Dessutom, möjligheten att upprepa hudbiopsi i samband med uppföljningen av samma patient gör det möjligt att studera den längsgående korrelation med sjukdomsprogression. Vi satte upp ett standardiserat tillförlitligt protokoll för att undersöka närvaron av αSyn aggregat i hud nerv fibrer av PD-patienten. Detta protokoll innebär få kort fixering steg, en cryotome snittning och sedan en fritt flytande immunofluorescens dubbel färgning med två specifika anti kroppar: anti protein Gene produkt 9,5 (PGP 9.5) för att markera den kutana nerv fibrer och anti 5g4 för att upptäcka αSyn aggregat. Det är en mångsidig, känslig och lätt att utföra protokoll som också kan tillämpas för att rikta andra proteiner av intresse i hud nerver. Förmågan att markera αSyn aggregat är ytterligare ett steg framåt till användningen av hudbiopsi som ett verktyg för att fastställa en pre-mortem histopatologisk diagnos av PD.
Introduction
Hudbiopsi har fått en stor betydelse som diagnostiska och forsknings verktyg inom området neurologiska sjukdomar1. I själva verket innehåller epidermis och dermis rikliga somatiska sensoriska nerv fibrer (myeliniserade och unmyelinated), nociceptiva fria nerv ändar, sensoriska receptorer och autonom innervation av svett körtlar, fartyg, talgkörtlar och muskel arrector pilorum och 2.
I mitten av 20- talet, den setup för immunhistokemi av PGP 9.5 anti kropp tillät bevis på en omfattande innervation av mänskliga epidermis däggdjur hud3. PGP 9.5 är en carboxyl-Terminal hydrolas jämnt fördelad längs axoner av både centrala och perifera nerv systemet (PNS). Tillgängligheten av denna anti kropp tillät inte bara att klargöra morfologi och anatomi PNS i huden utan också genomfört studiet av sjukdomar i samband med det3,4. Hudbiopsi bidrog till att definiera en ny klinisk enhet: den lilla fiber neuropati. Flera internationella grupper visade sambandet mellan förlusten av intraepidermal nerv fibrer och symtom/tecken på små fiber neuropati5 av hudbiopsi analys och förutsatt standardiserade protokoll för nervmorphometry samt normativa referensvärden som skall användas i den kliniska praxisen6,7,8.
Nyligen en stor mängd bevis har visat att neurodegenerativa sjukdomar, som kännetecknas av felvikt protein ackumulationer i centrala nerv systemet, är flera system patologier9. I själva verket kännetecknas PD av αSyn ackumulering i dopaminerga neuron i substantia nigra, men det har visats att αsyn och dess patologisk form, fosforylerade αsyn (P-αsyn), kunde upptäckas också i perifera vävnader. Gastrointestinalt slem hinna10, saliv körtlar11, hud autonoma fibrer som omger svett körtlar och pilomotor muskler12,13,14, Visa immunoreaktivitet mot patogena former av αsyn, i enlighet med Braak hypotes som spännande postulat att αsyn patologi kan börja i PNS i god tid, innan dess ackumulering i hjärnan15. Vidare har förekomsten av p-αsyn påvisats i hud nerver hos patienter med rem-beteende störningar som anses prodromala PD16,17 på så sätt kan hudpatologiskt αsyn anses vara en lovande tidig perifer histopatologisk markör för synucleinopati.
Föreningen av små fiber neuropati i PD har visats tidigare och det har kon stater ATS att intraepidermal nerv fibrer densitet återspeglar sjukdomsprogression18,19. Därför är hudbiopsi ett användbart verktyg för att studera neurodegeneration i PD och för att etablera en pre-mortem histopatologisk diagnos av sjukdomen. I själva verket har hudbiopsi en stor fördel av att vara en lättillgänglig och minimalt invasiva förfarande, vilket gör att analysen av nervvävnad benägna att patologin. Slutligen, möjligheten att upprepa hudbiopsi i samband med uppföljning av samma patienter gör det möjligt att studera den längsgående korrelation med sjukdomsprogression.
I vårt laboratorium, utnyttja en dubbel immuno-färgning med PGP 9.5 och kon formation specifika monoklonala 5g4 anti kropp, som erkänner sjukdomsspecifika former av αsyn inklusive små aggregat20,21, kunde vi Visa den förekomst av αSyn aggregat i hudens nerver med en lovande hög diagnostisk verknings grad19. Immunofluorescens analys av hudbiopsi i överensstämningssjukdomar framstår som en lovande källa till bio markörer genom att kombinera både upptäckten av protein aggregat och måttet på neurodegeneration in vivo. Härefter illustrerar vi ett enkelt och mångsidigt protokoll om hantering av hudbiopsi och utförande av fritt flytande immunofluorescens-färgning för detektion av αSyn-aggregat. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att inrikta sig på alla andra intresse proteiner som uttrycks i hud-PNS.
Följande studie protokoll har använts för att utvärdera diagnos nyttan av aggregerad αSyn-analys i PNS för PD med hudbiopsi19. Inklusionskriterier för PD var: en definitiv klinisk diagnos enligt den brittiska Brain Bank diagnostiska kriterier, sjukdoms tid minst 3 år, ingen släkt historia, och ingen större kognitiv svikt eller stora dysautonomiska symptom i historien. Uteslutnings kriterier var kända orsaker till neuropati (glycated hemoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immunofixation, HIV, HCV, syfilis, och borrelios). Varje ämne genomgick 3 mm-diameter hudbiopsier på tre anatomiska platser (hals på C8 dermatomal nivå, lår 10 cm ovanför knäet, benet 10 cm över laterala fotled olus) på sidan, som var kliniskt mer drabbade. I allmänhet är följande protokoll om hantering av hudbiopsi och utföra fritt flytande immunofluorescens färgning och analys. Därför kan det anpassas och användas för att upptäcka andra proteiner av intresse för hud vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet har godkänts av kantonala etik kommittén och alla inskrivna försöks personer gav skriftligt informerat samtycke till studien.
1. hudbiopsi samling
- Låt en kvalificerad läkare utföra hudbiopsi i en lämplig klinisk miljö.
- Välj området för att utföra hudbiopsi och rengör den med en spritsudd.
- Bered bedövnings lösningen med 1 cc lidokain 2%.
- Med nålen parallellt med området, injicera lokal bedövning subkutant.
- Efter att ha kontrollerat effekten av anestesi, ta 3 mm engångs Punch och tillämpa roterande och delikat nedåt tryck för att rotera den ner genom epidermis och dermis, tills subkutant fett nås.
- Dra ut hålslag.
- Använd engångspincett för att försiktigt dra upp hud pluggen.
- Använd sax för att skära ut basen av preparatet på nivån av fett vävnad.
- Placera preparatet i ett rör som innehåller 10 mL fixativ lösning av periodatlysin-paraformaldehyd (PLP).
- Desinficera området och täck det med ett själv häftande bandage.
2. vävnads fixering och lagring
- Gör en ny fixativ lösning för PLP (se tabell 1).
- Omedelbart efter insamlingen av hudbiopsi, Sänk den i ett rör som innehåller 10 mL PLP fixativ lösning och inkubera den över natten (O/N) vid 4 ° c.
- Dagen efter, under rök Hood, ta bort PLP fixativ försiktigt och i samma slang, tvätta biopsi 3 gånger för 5 min med 5 ml 0,1 M Sorensen lösning (tabell 1).
- Kassera Sorensen lösning och inkubera biopsin med 5 mL Cryo-Protectant lösning O/N vid 4 ° c.
- Förvara biopsin vid 4 ° c om snittet med en cryotome utförs inom 1 vecka; Förvara biopsin vid-20 ° c om snittet utförs inom 3 månader; bädda in biopsin i en cryomold (steg 3.2-3.4) och förvara den på-80 ° c för att spara den under en längre tid.
3. vävnad cut med en Cryotome
- Ställ in cryotome vid-20 ° c.
- Ta en cryomold och fyll upp det med Cryo-inbäddning medium. Undvik att skapa bubblor.
- Använda pincett doppa biopsi i Cryo-inbäddning medium med den längsgående axeln (epidermis-dermis) parallellt med botten av cryomold.
- Snäpp frysa provet med flytande kväve för att få en solid kub av Cryo-inbäddning medium som innehåller biopsi i rätt riktning.
- Placera provet i kryostaten och vänta i 30 min för att låta biopsi att acklimatisera.
- Fixera provet på kryostaten och skär 50 μm sektioner.
- Med hjälp av en liten borste, överföra Cryo-sektioner i en 96 väl plattan innehåller 200 μL av Frost skydds vätska lösning i varje brunn. En sektion per brunn.
- Förvaras vid-20 ° c.
Anmärkning: Om analysera hela biopsi inte analyseras, skär den bara delvis. I detta fall skall avsnitten förvaras vid-20 ° c och resterande del av biopsin vid-80 ° c för att spara den under en längre tid.
4. immunofluorescens färgning
- Fyll en 96-platta med 100 μL tvätt lösning.
- Överför de sektioner som ska analyseras från förvarings plattan till den nya som innehåller tvätt lösningen. 1 avsnitt per brunn (4 sektioner per anatomisk webbplats, per patient: vanligt vis totalt 12 avsnitt per patient).
- Lämna sektionen i tvätt lösningen i 10 min vid rums temperatur (RT). Överför sektionen till en annan brunn som innehåller samma lösning och upprepa tvätten.
- Flytta avsnitten till nya brunnar som innehåller 100 μL Blockeringslösning och inkubera i minst 90 min och högst 4 timmar vid RT.
- Späd de primära anti kropparna mot PGP 9.5 (kanin polyklon, 1:1000) och anti-5G4 (Mouse monoklonala, 1:400) i arbets lösningen.
- Överför avsnitten till nya brunnar som innehåller 100 μL av den arbetande lösningen av de primära anti kropparna och inkubera dem O/N vid RT.
- Som steg 4,3, tvätta avsnitten 2 gånger i minst 10 min vid RT, med 100 μL tvätt lösning.
- Späd de sekundära anti kropparna (konjugatet med olika fluorophores) get anti-kanin för att detektera PGP 9.5 (1:700) och en Goat anti-Mouse för att detektera 5G4 (1:700) i arbets lösningen.
- Överför avsnitten till nya brunnar som innehåller 100 μL av den arbetande lösningen av de sekundära anti kropparna för 90 min vid RT. Från denna punkt, täck 96 väl plattan med aluminiumfolie för att undvika blekning av fluorophore konjugerat med sekundära anti kroppar/IES.
- Som steg 4,3, tvätta avsnitten 2 gånger i minst 10 min, med 100 μL av tvätt lösningen.
- Överför avsnitten till nya brunnar som innehåller 100 μL DAPI (utspädd 1:5000 i PBS 1x) i 5 min vid RT.
- Som steg 4,3, tvätta avsnitten 2 gånger i minst 10 min, med 100 μL av tvätt lösningen.
- Montera avsnitten på en bild i rätt läge undvika fel.
- Tillsätt några droppar av monterings mediet på bilden och täck med ett täckglas.
- Låt glasen torka O/N innan du använder konfokal/fluorescensmikroskop.
- Förvara bilderna i en lämplig ruta vid 4 ° c och Undvik ljus exponeringen. Om den lagras korrekt kommer signalen att synas i ca 6 månader.
Anmärkning: Överföringen av en sektion från 96-plattan med de Nyskurna skivorna till 96-plattan som innehåller tvätt lösningen (steg 4,1) utförs med en liten borste som hjälper till att plocka upp biopsin. Efter överföringen av sektionen till den första brunnen, varje gång segmentet behöver inkuberas med en annan lösning, flytta den från brunn till brunn med hjälp av borsten.
5. immunofluorescens Imaging
- Visa avsnitt under ett inverterat fluorescensmikroskop eller ett konfokal Mikroskop (20X, 40x eller högre förstoring, Använd successiva ramar av 2 μm steg på en Z-stack plan för bästa resultat).
- Hämta bilder med en Mikroskop ansluten kamera
-
Använd ett adekvat avbildnings program (dvs. ImageJ) för att analysera positiva signaler i sektioner i termer av geografisk fördelning och intensitet på signalen. För att göra detta utföra de steg som nämns nedan.
- Öppna filen med ImageJ-programvaran.
- Klicka på bild > färg > dela kanaler för att analysera varje färg kanal.
- Klicka på bild > stack ≫ Z-projekt för att få en sammanslagning av flera avsnitt förvärv.
- Klicka på bild > färg > sammanfoga kanaler för att få en sammanslagning av olika färg kanaler för samma anskaffning.
|
Frost skydds vätska (förvaras vid 4 ° c i upp till 6 månader) |
30% glycerol 30% etylenglykol 30% dH2O 10% 2x fosfatbuffert |
|
Blockering lösning (Förbered för tillfället) |
4% normalt get serum 1% Triton X-100 i tvätt lösning |
|
Cryo-Protectant (förvaras vid 4 ° c i upp till 6 månader) |
20% glycerol 80% Sorensen lösning |
|
Dinatriumvätefosfatlösning (förvaras vid RT upp till 6 månader) |
0,45 m dinatriumvätefosfat (Na2HPO4) i dH2O Filtrera i en steril flaska |
|
Lysinlösning (förvaras vid 4 ° c i upp till 3 veckor) |
50% av 0,3 M L-Lysinmonohydroklorid lösning 50% av 0.1 M Sorensen lösning pH 7,6 pH 7,4, filtrera i en steril flaska |
|
Paraformaldehyd (PFA) 8% (Förbered under rök Hood och förvara vid 4 ° c i upp till 1 månad) |
2,6 m PFA i dH2O (till 55 ° c _ överskrid inte 60 ° c filter i en steril flaska |
|
Fosfatbuffert 2x (förvaras vid 4 ° c i upp till 6 månader) |
6% monatriumfosfatlösning (NaH2PO4) 45% dinatriumfosfatlösning (Na2HPO4) i dH2O |
|
Fixativ lösning för PLP (Förbered just nu, under rök Hood) |
25% paraformaldehyd 8% 0.01 m natrium (meta) periodate 75% lysinlösning < |
|
Natriumdivätefosfatmonohydrat (förvaras vid RT upp till 6 månader) |
0,52 m natriumdivätefosfatmonohydrat (NaH2PO4 * H2O) i dH2O Filtrera i en steril flaska. |
|
Sorensen lösning (förvaras vid 4 ° c i upp till 1 månad) |
2,5% natriumvätefosfatlösning 18,7% dinatriumfosfatlösning pH 7,6, i dH2O |
|
Tvätt lösning (Förbered för tillfället) |
0,25 m Trizma-bas 0.26 m NaCl pH 7,6, i dH2O |
|
Arbets lösning (Förbered för tillfället) |
50% blockerande lösning 50% tvätt lösning |
I tabell 1: Lösningar som krävs. Förteckning över nödvändiga lösningar för protokollet och kortfattad beskrivning av hur man förbereder den.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den beskrivna proceduren (figur 1), upptäckte vi αsyn aggregat, märkta med 5G4 anti kroppar, i dermal nerv fascicles innerverar autonoma strukturer av PD-patienter. Morfologi av alfa-Synuclein insättningar visas som en prickig signal längs axoner av dermal nerver (figur 2). Faktum är att utnyttja detta protokoll hos 19 PD patienter och 17 kontroller i hudbiopsier på tre anatomiska området (livmoder hals cancer, lår och distala benet) fann vi att 5G4 hade 81% av känslighet och 86% av specificitet respekt för friska kontroller och P-αSyn hade 56% av känslighet och 100% av specificiteten19.
I synnerhet fann vi 5G4 och P-αSyn positiva insättningar främst i nerver runt svett körtlar men också i muskeln Erector Pili, små fartyg, och Subepidermal och dermal plexus, aldrig i intraepidermal nerv fibrer.
Generellt, inom svett körtel lumen, är det möjligt att observera en icke-specifik signal, som kan misstolkas som 5G4/P-αSyn positivitet. Denna typ av signal är prickig, sfärisk och det beror troligen på svalgmanometri Auto-fluorescerande material, som vi visat i tekniska kontroller utan primära och sekundära anti kroppar (figur 3). Co-lokalisering med PGP 9.5 som markerar nerv fibrerna, som morfologiskt är trådformiga och långsträckta, hjälper till att identifiera rätt signal. Därför är specificiteten hos 5G4-signalen mycket förhöjd med en dubbel immunofärgning med en axonal markör (figur 4).
En noggrann fixering av biopsi är en obligatorisk faktor för god kvalitet på immunofluorescens färgning, och för tillförlitlig tolkning av fluorescerande signaler. Om fixativ inte är korrekt för beredd eller om en överfixering har inträffat, blir resultatet en hög Auto-fluorescens som kommer att maskera signalen av nerv fibrer korsar dermal-epidermal korsning eller innerverar de viktigaste dermal strukturer (figur 5 B, D, F). I detta fall, oförmågan att visualisera korrekt PGP 9.5 positiva fibrer kommer att göra svårt att analysera korrekt också 5G4.
Slutligen kan detta protokoll användas för att påvisa något protein av intresse, bland annat αSyn, P-αSyn eller tyrosinhydroxylase (TH) och vasoaktiv intestinal peptid (VIP) som markerar respektive adrenerga och kolinerga subtyp av autonoma innervation (figur 6).
Figur 1 : Schematisk representation av protokollet. Grafisk representation av kritiska steg i fixering, skärning och färgning av hud sektioner för visualisering av αSyn aggregat i kutan perifera nerv fibrer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Förekomst av 5G4 aggregat i dermal nervös fibrer. Confocal sammanslagna Z-stack bilder av immunofluorescens med PGP 9.5 (grön) och 5G4 (röd) av dermal nerver runt svett körtlar hos PD-patienter (a – C) och friska ämne (D-F). Denna siffra ändras från 19. 3D visualisering av samma svett körtel visade ovan från PD (G) och friska (H) försöks personer. Indikeras av vita pilar, gul colocalization av de två markörer längs axoner. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Auto-fluorescerande signaler: tekniska kontroller. Confocal sammanslagna Z-stack bilder av hud sektion färgas med DAPI och utan den primära anti kroppen (A-B), utan den sekundära anti kroppen (C-D), utan primära och sekundära anti kroppar (E-F). Bilderna visar närvaron av icke-specifika prickiga signaler i svett körtlar strukturer under alla förhållanden. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Överväg nerv fibrer morfologi att känna igen icke-specifik signal. Confocal sammanfoga Z-stack bilder av immunofluorescens med PGP 9.5 (grön) och 5G4 (röd) av dermal nerver runt svett körtlar. Vita pilar indikerar positiva strukturer; asterisker indikerar ospecifik färgning i icke-neuronala strukturer. Skalbar = 50 μm. Denna siffra ändras från referens19. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Felaktig fixering äventyrar kvaliteten på färgning av immunofluorescens. Confocal sammanfoga Z-stack bilder av immunofluorescens med PGP 9.5 (grön) och DAPI (blå) av Intra epidermal nerver fibrer (A-B) och dermal nerver runt talgkörtelaktiviteten (C-D) och svett körtlar (E-F). På det vänstra resultatet av korrekt fixering, på rätt resultat av över fixering. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Exempel på andra proteiner som detekterbara i hudens nerver. Mikroskop bilder av hud strukturer färgade med hjälp av en fritt flytande immunofluorescens analys. I rött αSyn (a), p-Αsyn (B) och th (C), i grönt VIP (D). Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en fritt flytande immunofluorescens test för hudbiopsier för diagnos av PD: det utnyttjar dubbel immunofärgning med anti-PGP 9.5 anti kropp, en panaxonal markör, och anti-5G4, en kon formation specifik anti kropp som erkänner den aggregerade formen av αSyn.
De stora fördelarna med hudbiopsi för diagnostiskt syfte i PD och möjligen i andra proteiner kon Formations rubbningar är: 1) direkt till gång till nervvävnad benägna att sjukdomen genom en milt invasiv teknik och därmed med en förväntad bättre beslutsamhet känslighet för αSyn aggregat än biologiska vätskor som blod eller CSF; 2) möjlighet att upptäcka och kvantifiera Epidermal och autonom nerv fiber densitet som ett mått på neurodegeneration; 3) möjligheten att upprepa hudbiopsi i samband med uppföljning av samma patienter, för att studera longitudinellt sambandet med sjukdomsprogression.
Det protokoll som föreslås här är snabbt, mångsidigt och har få kritiska steg. Först av allt, vävnad fixering måste eftersträvas korrekt, annars en hög Auto-fluorescens kommer att maskera den specifika signalen och kommer att förhindra korrekt analys av data. Paraformaldehyd i den fixerande lösningen bör göras fräsch och pH-värdet 7,4 bör kontrol leras noggrant. Det är oerhört viktigt att undvika bildandet av myrsyra som kan skada biopsier. Om biopsiens kompakthet antyder en felaktig fixering bör biopsin, före lagring och skärning, sköljas igen med Sorensen lösning och ominkuberas med PLP-lösning O/N vid 4 ° c. I början eller slutet av Färgnings protokollet för immunofluorescens kan dessutom några ytterligare steg införas för att motverka autofluorescens. I början av protokollet (mellan steg 4,1 och 4,2) en behandling med natriumborohydridlösning (1 mg/mL i TBS, 3 gånger i 10 min), en behandling med väteperoxid (3%; 15 min) eller en behandling med glycin (0,1 M i TBS; 1H) kan utföras. I alternativ i slutet av infärgning (mellan steg 4,8 och 4,9), en behandling med trypan blå (250 μg/mL i TBS, 20 min) eller med Sudan Black (0,5% i 70% EtOH; 30 min) kan utföras. Men i alla fall, förutom minskningen av Auto-Fluorescence, en minskning av den specifika signalen kommer också att inträffa. Alternativt kan biopsier felaktigt fixeras användas för att utföra klassisk ljus fält immunohistokemi. I detta fall kommer dock dubbel immunofärgning för colocalization av 5G4 och PGP 9.5 vara mer utmanande och svårt att analysera.
Ett annat viktigt steg är införandet av en hudbiopsi i cryomold (steg 3,3). Inriktningen av biopsi mot skär bladet är avgörande för att få skivor där epidermis och dermis är båda närvarande. Den längsgående axeln (epidermis-dermis) måste vara parallell med botten av cryomold, så att sidan av biopsi, inte toppen eller botten, står inför operatören. Valet av skivor tjocklek, 50 μm, är i enlighet med Europeiska rikt linjer för användning av hudbiopsi som ett diagnostiskt verktyg7. Dessutom, för en αSyn aggregat detektering, 50 μm tjocklek tillåter med större sannolikhet att ha inom sektionen mer dermal strukturer, där patologisk deposition främst återfinns i PD. på grund av den höga tjock leken, för att vara säker på att hela sektionen är färgad, är det rekommenderas inte att placera avsnitten på bilden för färgning, utan i stället en fri flytande färgning är obligatoriskt. För detta förfarande är den största svårigheten att överföra avsnitten från en brunn till en annan med hjälp av en liten borste utan att skada avsnitten. Det rekommenderas att sätta in spetsen på borsten under biopsi som flyter i vätskan, vilket gör att biopsi att bosätta sig på spetsen av borsten, försiktigt bära biopsi från en brunn till en annan, Sänk biopsi i den nya lösningen och ta bort borsten att se till att inga biopsirester finns kvar på borsten. Det är viktigt att operatören förvärvar manuella färdigheter med praktiska övningar.
Sammanfattnings vis är detta ett kort och enkelt protokoll för optimal hantering och fluorescerande immunofärgning av hudbiopsi. Fördelen med detta protokoll i förhållande till tidigare studier är användningen av 5G4 anti kroppar, vilket gör det möjligt att upptäcka αSyn små aggregat för första gången i dermal autonoma nerv fibrer av PD-patienter. Det kan potentiellt användas för diagnostiska ändamål i olika typer av neurodegenerativa sjukdomar som involverar PNS, särskilt i tidiga faser, när potentiella Bote medel kan vara mest effektiva. Begränsningar av metoden är att känslighet P-αSyn och specificitet 5G4 är fortfarande suboptimala men en kombination av olika markörer i framtida studier kan säkert förbättra den diagnostiska avkastningen av hudbiopsi i PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Parkinson Schweiz och ABREOC (den vetenskapliga forsknings råd givande nämnden för Ente Ospedaliero Cantonale) för deras ekonomiska stöd för denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5G4 (anti human αSyneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Mouse monoclonal |
| AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Disodium hydrogen phosphate solution | Merk Millipore | 106586 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehyde | Aldrich Chemistry | 441244 | |
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | Rabbit polyclonal |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck Millipore | 106346 | |
| Sodium (meta)periodate | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Mounting medium |
References
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
- Wang, L., et al. Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin. Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).
- Holland, N. R., et al. Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy. Neurology. 48, 708-711 (1997).
- McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).
- Provitera, V., et al. A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg. European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).
- Wakabayashi, K., et al. Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain. Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).
- Ruffmann, C., et al. Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease. Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).
- Lee, J. M., et al. The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).
- Donadio, V., et al. Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease. Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).
- Doppler, K., et al. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).
- Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy. Brain. 138, 2310-2321 (2015).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
- Doppler, K., et al. Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease. Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).
- Antelmi, E., et al. Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder. Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).
- Nolano, M., et al. Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Melli, G., et al. Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).
- Kovacs, G. G., et al. Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread. Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).
- Kovacs, G. G., et al. An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology. Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).
