마우스 간에서 담관 밀도 결정
Summary
우리는 마우스 간에서 담관 밀도의 정확한 정량화를 위한 다소 간단하고 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법은 유전 및 환경 수정자의 효과와 담즙 질환의 마우스 모델에서 잠재적 인 치료의 효과를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Abstract
마우스는 담즙 질병을 연구하는 모형 유기체로 광범위하게 이용됩니다. 담즙 계통의 발달 그리고 기능을 평가하기 위하여는, 특정 마커를 위한 혈청 화학, 조직학 분석 및 면역 얼룩을 포함하여 각종 기술이 이용됩니다. 이 기술은 담즙 시스템에 관하여 중요한 정보를 제공할 수 있더라도, 그(것)들은 수시로 전체 간을 통해 담관 (BD) 발달 결함의 전체 그림을 제시하지 않습니다. 이것은 부분적으로 담 즙 개발에 상당한 장애를 가진 동물에서 담 즙을 배출 하는 마우스 간의 강력한 능력 때문. 여기에서 우리는 돌연변이/형질전환 마우스의 모든 로브를 포함하는 단면도에 있는 각 문맥 (PV)와 관련되었던 BDs의 평균 수를 계산하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법에서는, 간은 각종 유전형 및 실험 조건 사이 비교를 용이하게 하기 위하여 입체적인 방식으로 거치되고 단면화됩니다. BDs는 세포각증 염색 담관옥시의 가벼운 현미경 검사를 통해 확인된 다음 간 절편에 존재하는 총 PV 수로 계산및 분할됩니다. 예를 들어, 우리는이 방법이 명확하게 야생 형 마우스와 Alagille 증후군의 마우스 모델을 구별 할 수있는 방법을 보여줍니다. 여기에 제시된 방법은 담즙 나무의 3 차원 구조를 시각화하는 기술을 대체 할 수 없습니다. 그러나, BD 발달 및 마우스에 있는 연성 반응 대형의 정도를 정량적으로 평가하는 쉽고 직접적인 방법을 제공합니다.
Introduction
담즙 나무는 포유류 간에서 중요 한 부분, 창 자에 간 세포에서 담 즙의 통과 허용. 간간 간 담관 (BDs)은 융기양양에 의해 형성되며, 이는 노치 및 TGFβ 신호전달을통해 이중 전위 간폭발과 구별되는 1,2. 성숙한 BD에 담관과 그들의 어셈블리의 적당한 명세서 그리고 투입은 간 간 담즙 나무의 발달을 위해 중요합니다. 간 개발 또는 장기 재생 시 성장, 담 즙 시스템 적절 한 담 즙 배수를 보장 하기 위해 간 따라 개발 해야. 더욱이, 많은 신디로믹 및 비 신드로믹 질환은 간간 BDs3의빈약성을 초래한다. 또한, 다수의 급성 및 만성 간 질환은 담즙 마커를 발현하지만 담즙 세포 또는 형태에서 반드시 발생하지 않는 상당수의 세포의 존재로 정의되는 간에서 소위 연성 반응을 초래합니다. 특허 BDs4. 다중시스템 장애인 알라길증후군(ALGS)에서, 노치 리간드의 하플로인스실핍증1(JAG1)은BD 형성이 불량하고 담즙정체증5,6. 우리의 실험실은 최근에 이전에 생성 된 Jag1 이형 마우스 라인 7이 ALGS 8에서BD 빈곤의 동물 모델임을 입증했습니다. ALGS의 이 마우스 모델에서는 담관옥시트가 여전히 존재합니다. 그러나, 그들은 성숙한 특허 BDs 8에통합을 커밋하지 못합니다. 따라서 BD 빈곤의 모델에서 간을 분석하려면 담관옥시의 명백한 존재 또는 부재 이상이 필요합니다. 성숙한 BDs가 간에서 존재하는 정도를 정확하게 평가하는 것이 중요합니다.
해부학 병리학에서는 BD 빈곤이 존재하는지 여부를 평가하기위한 허용 된 양적 방법이있습니다 9. 예를 들어, 인간 환자에서 ALGS에 대한 연구는 간 생검9,10개당 적어도 10개의 포탈 혈관을 분석하여 BD를 포탈 정맥(PV) 비율로 정량화한다. 혈청 화학과 결합된 특허 BD의 모양 및 전반적인 존재 또는 부재의 분석은 마우스11,12,13에서BD 개발에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 그러나, 마우스는 혈청 빌리루빈 수준 8에 있는 단지 겸손한 증가와BDs의 상당한 수를 분실할 수 있습니다. 따라서, PV당 존재하는 BDs의 수를 평가하는 정량적 방법은 마우스에서 BD 빈곤의 정도를 보다 직접적으로 측정할 수 있다. 최근 보고서에서, 우리는 모든 간 엽에 걸쳐 PV 당 BDs의 수를 정량화하고 Jag1 +/– 동물8에서PV 비율에 BD에 있는 중요한 감소를 보고했습니다. 분석 과정에서 염증 반응 및 연성 반응의 정도가 현저한 변동에도 불구하고 BD 대 PV 비율은 많은가변성을 나타내지 않는 것으로 나타났습니다 8. 더욱이, BD 대 PV 비율의 정량화는 우리가 Jag1+/-에서 글리코실트랜스퍼라제 유전자 Poglut1의 1개의 사본을제거하는 것이 그들의 BD 빈곤8을 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 입증하는 것을 허용했다. Jag1+/+ 배경에서 혈관 평활근 세포에서 Poglut1의 조건부 손실은 BD 수치의 점진적 인 증가를 초래합니다(20-30%). P7에서 하지만 성인에서 눈에 띄는 된다8. 다시 말하지만, 이 기술은 P7에서도 이러한 동물의 BD 밀도의 증가가 통계적으로 유의하다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 참고로, 생후 4개월에 이 유전자형의 증가된 BD 밀도는 수지 주조 분석을 통해서도 검증되었다. 8 다른 ALGS 마우스 모델14,15에서 BD 밀도를 측정한 이러한 관찰 및 기타 보고서는 다양한 돌연변이체의 담즙 결함을 분석하기 위한 전체 전략에 이 방법을 통합하도록 유도했습니다. 및 형질전환 마우스.
여기서, 간 질환의 마우스 모델에서 BD 빈곤의 정도를 검사하는데 사용될 수있는 간단한 기술을 상세히 기술한다(도 1). 이 방법에서, 콜란지오시포르테 마커 시토케라틴(CK) 8 및 CK19(이하 광스펙트럼 CK, wsCK)와 함께 공동 염색하는 것은 마우스 간에서 BD및 통합되지 않은 담관옥을 가시화하는데 사용된다. 알파 평활근 액틴(αSMA)에 대한 항체가 라벨 용기에 염색에 첨가된다. 모든 간 엽을 덮는 단면도에서 BD 대 PV 비율의 체계적인 분석은 각 유전자형에 대해 많은 수의 PV를 분석할 수 있도록 합니다. 우리의 방법은 2D 이미지에서 BD와 PV를 정량화에 의존하기 때문에, 담즙 나무의 3D 구조 또는 작은 담즙 도관의 무결성에 주어진 돌연변이의 효과를 연구하기에 적합하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 마우스에 담즙 발달을 평가하기 위하여 조사자가 간단하고 객관적인 전략을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스에서 BD 발달 및 수리의 분석은 담대성 무질서의 병인 그리고 기계장치를 공부에 있는 중요한 공구입니다. 또한, 새로운 치료법의 개발은 부분적으로 재현가능하고 바람직하게는 정량화 가능한 표현형을 확립하는 데 의존한다. 마우스 모형에 있는 현재 표현형은 일반적으로 세포 모형 특정 마커를 위한 혈청 화학, 간 신체 학 및 면역 염색을 관련시킵니다. 이러한 기술은 담즙 시스템의 구?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국립 보건원 (NIH)의 지원을 인정 (R01 GM084135 및 R01 DK109982), NIH P30 DK56338에서 텍사스 의료 센터 소화기 질환 센터에서 파일럿 / 타당성 상, 그리고 알라질 증후군 가속기 상에서 의료 재단.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
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