Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi
Summary
Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğunun doğru ölçülmesini yapmak için oldukça basit ve hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, genetik ve çevresel değiştiricilerin etkilerini ve biliyer hastalıklarının fare modellerinde potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemede yardımcı olabilir.
Abstract
Mouse, safra hastalıklarının incelenmesi için geniş bir model organizma olarak kullanılır. Safra sisteminin gelişimini ve fonksiyonunu değerlendirmek için, serum kimya, histolojik analiz ve spesifik belirteçleri için immünostik dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılır. Bu teknikler safra sistemi hakkında önemli bilgiler sağlayabilse de, genellikle tüm karaciğer genelinde safra kanalı (BD) gelişimsel kusurları tam bir resim sunmaz. Bu kısmen safra gelişiminde önemli düşüklüğü olan hayvanlarda bile su drenajı için fare karaciğerinin sağlam yeteneği nedeniyle. Burada, mutant/transjenik farelerin tüm lobları kapsayan bölümlerde her portal ven (PV) ile ilişkili ortalama BDs sayısını hesaplamak için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemle, ciğeri çeşitli genotürleri ve deneysel koşullar arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için stereotifik bir şekilde monte ve kesitli. BDs, sitolatin-lekelenmiş kolanjiositlerin ışık mikroskobu ile tanımlanır ve daha sonra sayılan ve karaciğer bölümünde mevcut PVs toplam sayısına bölünmüştür. Örnek olarak, bu yöntemin vahşi tip fareler ile Alagille sendromunun fare modelini açıkça nasıl ayırt edebilmesi gerektiğini gösteriyoruz. Burada sunulan yöntem, biliyer ağacının üç boyutlu yapısını görselleştiren tekniklerin yerini alamaz. Ancak, BD gelişimini ve farelerde Ductular reaksiyon oluşumunun derecesini niceciksel olarak değerlendirmek için kolay ve doğrudan bir yol sunar.
Introduction
Safra ağacı, memeliler karaciğerinin önemli bir parçasıdır ve safra, hepatositlerden bağırsak içine geçişine izin verir. İntrahepatik safra kanalları (BDS), bipotel hepatoblastlardan çentik ve tgfβ sinyal1,2ile ayırt edilen kolanjiositlerden oluşur. Uygun belirtimi ve cholangiocytes taahhüdü ve olgun BDs içine onların montaj intrahepatik safra ağacının gelişimi için önemlidir. Karaciğer gelişimi sırasında ya da organ rejenerasyonu üzerine büyüdükçe, safra sistemi uygun karaciğer drenaj sağlamak için karaciğerde geliştirilmesi gerekir. Dahası, bir dizi sendromli ve sendromic olmayan hastalıklar intrahepatik BDs3‘ ün salılarına neden olur. Buna ek olarak, akut ve kronik karaciğer hastalıklarının bir dizi karaciğerde sözde Ductular reaksiyonlara yol açtı, bu biliyer işaretçileri ifade ama mutlaka biliyer hücrelerinden veya formu ortaya çıkmaz hücrelerin önemli sayıda varlığı olarak tanımlanır Patent BDs4. Multisistem bozukluğu olan Alagille Sendromu (algs), çentik ligand jagged1 (JAG1) kötü BD oluşumu ve kolestaz5,6‘ da oluşan haployetmezlik. Laboratuvarımız, daha önce oluşturulan Jag1 heterozigot fare hattı7 ‘ nin algs8‘ de BD yetersizlik ‘nin hayvan modeli olduğunu göstermiştir. ALGS bu fare modelinde, kolanjiositler hala mevcut. Ancak, Olgun, patent BDs8içine birleşme taahhüt başarısız. Bu nedenle, BD yetersizlik bir model içinde karaciğer Analizi belirgin varlığı veya kololgiocytes yokluğunda daha fazla gerektirir. Hangi olgun BDs karaciğer mevcut derecesi doğru değerlendirmek önemlidir.
Anatomik patolojide, BD ‘nin%9‘ unda var olup olmadığını değerlendirmek için nicel Yöntemler kabul edilmektedir. Örneğin, insan hastalarında algs üzerinde çalışmalar genellikle karaciğer biyopsisi başına en az 10 Portal gemileri analiz ederek BD portalı ven (PV) oranı ölçmek9,10. Şekil ve patent BDS genel varlığı veya yokluğu analizi, serum kimya ile birlikte, fareler içinde BD gelişimi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir11,12,13. Ancak, fareler, serum bilirubin seviye8‘ de sadece mütevazı bir artış Ile BDS önemli sayıda kaybedebilir. Buna göre, PV başına mevcut olan BD ‘lerin sayısını değerlendiren bir nicel Yöntem, farelerde BD yetersizlik derecesini daha doğrudan ölçmek sağlayabilir. Son zamanlarda yapılan bir raporda, PV başına tüm karaciğer lobları boyunca BD ‘lerin sayısını ölçülebilir ve Jag1 +/– Animals8‘ de BD-PV oranındaki önemli bir azalma bildirdi. Analizimiz sırasında, inflamatuar reaksiyon ve Ductular reaksiyonları derecesine rağmen önemli bir varyasyona karşın, BD ‘ye PV oranı çok değişkenlik göstermez8. Dahası, BD ‘nin PV oranlarının ölçülmesi, Jag1 +/– hayvanların glikosyltransferaz geni Poglut1 bir kopyasını kaldırmanın BD yetersizlik8‘ i önemli ölçüde iyileştirebilmemizi sağladı. Bir Jag1 +/+ arka planda, vasküler pürüzsüz kas hücrelerinde Poglut1 koşullu kaybı, BD numaralarının ilerici bir artışla sonuçlanır, bu da mütevazı (% 20-30) P7 ama yetişkinler8önemli olur. Yine bu teknik, P7 ‘de bile bu hayvanlarda BD yoğunluğundaki artışın istatistiksel olarak önemli olduğunu göstermemize izin verdi. Not: Bu genotipteki artan BD yoğunluğu dört aydır, reçine döküm analizi ile de doğrulandı. 8 bu gözlemler ve farklı algs fare modellerinde BD yoğunluğu ölçülen diğer raporlar14,15 çeşitli mutant biliyer kusurları analiz etmek için genel stratejisine bu yöntemi birleştirmek için bize istenir ve transjenik fareler.
Burada, karaciğer hastalığının fare modellerinde BD yetersizlik derecesini incelemek için kullanılabilecek basit bir teknik ayrıntılarıyla (Şekil 1). Bu yöntemle, cholangiocyte işaretçiler Sito (CK) 8 ve CK19 (bundan sonra geniş spektrumlu CK, wsCK) ile birlikte boyama, fare karaciğerinde BDs ve uncorporated cholangiocytes görselleştirilmesi için kullanılır. Alfa-pürüzsüz Kas aksini (αSMA) karşı bir antikor etiket gemiler için boyama eklenir. Tüm karaciğer lob ‘lar kapsayan bir bölümde BD PV oranı sistematik Analizi her genotip için çok sayıda PV analiz edilmesini sağlar. Yöntemimiz 2D görüntülerde BDs ve PV ‘lerin ölçülmesi üzerine bağlı olduğundan, belirli bir mutasyonun safra ağacının 3D yapısında veya küçük safra kanallarının bütünlüğünü incelemek için uygun değildir. Yine de, müfettişlerin fareyle biliyer gelişimini değerlendirmek için basit ve objektif bir strateji sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farelerde BD gelişimi ve onarımının incelenmesi, kolestatik bozuklukların patogenezi ve mekanizmasının incelenmesi konusunda önemli bir araçtır. Buna ek olarak, yeni tedavilerin geliştirilmesi kısmen tekrarlanabilir ve tercihen ölçülebilir fenotip kurulması üzerine bağlıdır. Fare modellerinde mevcut fenotipleme genellikle serum kimya, karaciğer histolojisi ve hücre tipi spesifik işaretçileri için immünostatik içerir. Bu teknikler biliyer sisteminin yapısı ve işlevi hakkında değerli bilgile…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Sağlık Ulusal Enstitüleri (NıH) (R01 GM084135 ve R01 DK109982), bir pilot/fizibilite Ödülü Teksas Tıp Merkezi sindirim hastalığı Merkezi NıH P30 DK56338 altında destek kabul ve bir Alagille Sendromu Hızlandırıcı Ödülü Tıp Vakfı.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
Riferimenti
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
