Определение плотности bile Duct в мышечной печени
Summary
Мы представляем довольно простой и чувствительный метод для точной количественной оценки плотности желчных протоков в печени мыши. Этот метод может помочь в определении воздействия генетических и экологических модификаторов и эффективности потенциальных методов лечения в мышиных моделях желчных заболеваний.
Abstract
Мышь широко используется в качестве образцового организма для изучения желчных заболеваний. Для оценки развития и функционирования желчной системы используются различные методы, в том числе химия сыворотки, гистологический анализ и иммуностохинирование для конкретных маркеров. Хотя эти методы могут предоставить важную информацию о желчной системе, они часто не представляют полную картину желчных протоков (BD) дефектов развития всей печени. Отчасти это связано с надежной способностью печени мыши слива желчи даже у животных со значительными нарушениями в желчных развития. Здесь мы представляем простой метод для расчета среднего числа BD, связанных с каждой вены портала (PV) в разделах, охватывающих все доли мутантов / трансгенных мышей. В этом методе, печи установлены и разделены в стереотипном порядке, чтобы облегчить сравнение между различными генотипами и экспериментальных условиях. BDs определены с помощью световой микроскопии цитокератин окрашенных холангиоцитов, а затем подсчитывается и делится на общее количество. присутствует в печени разделе. В качестве примера мы покажем, как этот метод может четко различать мышей дикого типа и мышиную модель синдрома Алагиля. Представленный здесь метод не может заменить методы, которые визуализируют трехмерную структуру желчного дерева. Тем не менее, он предлагает простой и прямой способ количественно оценить развитие BD и степень образования протоковых реакций у мышей.
Introduction
Дерево желчных колдеев является важнейшей частью печени млекопитающих, что позволяет проход желчи из гепатоцитов в кишечник. Интрахепатические желчные протоки (БД) образуются холангиоцитами, которые отличаются от бипотенциальных гепатобластов через Нотч и TGF, сигнализирующих1,2. Правильная спецификация и приверженность холангиоцитов и их сборки в зрелые БД имеют решающее значение для развития внутрипеченочного желчного дерева. По мере того как печенка растет во время развития или на регенерации органа, желчьная система должна превратиться вдоль печенки для того чтобы обеспечить правильный дренаж желчи. Кроме того, ряд синдромных и несиндромных заболеваний приводят к нехватке внутрипечеачных БД3. Кроме того, ряд острых и хронических заболеваний печени приводят к так называемым протокическим реакциям в печени, которые определяются как наличие значительного количества клеток, которые выражают желчных маркеров, но не обязательно возникают из желчных клеток или формы патент BDs4. При многосистемном расстройстве синдром Алагиля (ALGS), гаплоинстоцификция нот лиганда jagged1 (JAG1) приводит к плохой формации BD и холестаз5,6. Наша лаборатория недавно показала, что ранее сгенерированный Jag1 heterozygous мыши линии7 является животной моделью BD скудости в ALGS8. В этой мышиной модели ALGS, холангиоциты все еще присутствуют. Тем не менее, они не в состоянии взять на себя обязательство по включению в зрелые, патентНые БД8. Поэтому анализ печени в модели скудности БД требует большего, чем кажущееся наличие или отсутствие холангиоцитов. Важно точно оценить степень присутствия зрелых БД в печени.
При анатомической патологии существуют принятые количественные методы оценкитого, существует ли нехватка БД 9. Например, исследования по ALGS у пациентов часто количественно BD портал вены (PV) соотношение путем анализа по крайней мере 10 портал судов на биопсию печени9,10. Анализ формы и общего наличия или отсутствия патентных БД, в сочетании с химией сыворотки, может предоставить ценную информацию о развитии БД у мышей11,12,13. Тем не менее, мыши могут потерять значительное количество BDs только скромное увеличение уровня билирубина сыворотки8. Соответственно, количественный метод, который оценивает количество БД, присутствующих на П.В. может обеспечить более прямой показатель степени скудности БД у мышей. В недавнем докладе, мы количественно количество БД на П.В. во всех долях печени и сообщили о значительном снижении соотношения БД к. в Jag1 /- животных8. В ходе нашего анализа, мы заметили, что, несмотря на значительные различия в степени воспалительных реакций и протоковых реакций, Соотношение БД к П.В. не показывает большой изменчивости8. Кроме того, количественная оценка соотношения БД к П.В. позволило нам продемонстрировать, что удаление одной копии гена гликозилтрансферазы Poglut1 в Jag1 ‘/-животные могут значительно улучшить их скудость BD8. На фоне Jag1/’, условная потеря Poglut1 в сосудистых гладких мышечных клетках приводит к постепенному увеличению числа БД, что является скромным (20-30%) на P7, но становится видным у взрослых8. Опять же, этот метод позволил нам показать, что даже при P7, увеличение плотности BD у этих животных является статистически значимым. Следует отметить, что увеличение плотности BD в этом генотипе в возрасте четырех месяцев было подтверждено с помощью анализа бросок по миске, а также. 8 Эти наблюдения и другие отчеты, которые измеряли плотность BD в различных моделях мыши ALGS14,15 побудило нас включить этот метод в нашу общую стратегию для анализа желчных дефектов в различных мутантов и трансгенных мышей.
Здесь мы подробно простой метод, который может быть использован для изучения степени Скудобы BD в мышиных моделях заболевания печени(рисунок 1). В этом методе, совместное окрашивание с холангиоцитов маркеров цитокератин (CK) 8 и CK19 (в дальнейшем широкий спектр CK, wsCK) используется для визуализации BDs и неинкорпорированных холангиоцитов в печени мыши. Антитела против альфа-гладкой мышечной актина (ЗСМА) добавляется к окрашиванию для обозначения сосудов. Систематический анализ соотношения БД и П.В. в разделе, охватывающем все доли печени, гарантирует, что для каждого генотипа анализируется большое количество П.В. Так как наш метод опирается на количественную оценку BD s и PVs в 2D изображениях, он не подходит для изучения влияния данной мутации на 3D-структуру желчного дерева или целостность небольших желчных каналов. Тем не менее, он обеспечивает простую и объективную стратегию для исследователей для оценки желчного развития в мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ развития и ремонта БД у мышей является важным инструментом в изучении патогенеза и механизма холестатических расстройств. Кроме того, разработка новых методов лечения частично зависит от создания воспроизводимого и предпочтительно поддающегося количественной оценке фенотип?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01 GM084135 и R01 DK109982), пилот / Доступность премии от Техасского медицинского центра пищеварительной болезни центр под NIH P30 DK56338, и Алагил синдром Ускоритель премии от Медицинский фонд.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
Riferimenti
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
