התפתחותם של התרבויות החיידקי רדיויניום בצלחות microtiter מאפשר דגימת תפוקה גבוהה המאפשרת שכפול טכני וביולוגי מרובים מספר השפע של הבריכה נוקלאוטיד, כולל זה של (p) ppGpp. ההשפעות של מעברים צמיחה שעוררה מקורות של לחץ פיזיולוגי, כמו גם התאוששות מהלחץ ניתן לפקח.
(P) הנוקלאוטיד ppGpp מתפקד כווסת גלובלי בחיידקים בתגובה למגוון רחב של מתח פיזי ותזונתי. יש לו התחלה מהירה, בשניות, אשר מוביל להצטברות של רמות הגישה או לחרוג אלה של בריכות GTP. היפוך מתח מקרים היעלמות מהירה של (p) ppGpp, לעתים קרובות עם מחצית חיים של פחות מדקה. הנוכחות של (p) ppGpp תוצאות שינויים של ביטוי גנים סלולריים ומטבוליזם המונה את ההשפעות המזיקות של מתח. גראם שליליים וחיידקים גראם חיוביים יש מנגנוני תגובה שונים, אבל שניהם תלויים (p) הריכוז ppGpp. בכל מקרה, יש צורך לנטר בו הרבה תרבויות בקטריאלי רדיויניום במרווחי זמן שעשויים להשתנות מ 10 שניות לשעות במהלך תקופות מעבר הלחץ הקריטי. פרוטוקול זה מטפל באתגר הטכני הזה. השיטה מנצלת חממות מבוקרת טמפרטורה ושייקר מבוקרים המאפשרים ניטור מקבילי של הצמיחה (ספיגה) ודגימה מהירה של תרבויות הפוספט האחיד והחד כדי לפתור ולכמת בריכות נוקלאוטיד כרומטוגרפיה בעלת שכבה דקה. בפיי-תאית כמויות קטנות של דגימה נחוצות עבור שכפול טכני וביולוגי מרובים של ניתוחים. מעברים צמיחה מורכבים, כגון הצמיחה diauxic ו מהירה (p) שיעורי המחזור ppGpp ניתן לכמת המוערך על ידי שיטה זו.
השליח (p) ppgpp השני הוא מווסת גלובלי המודוללי את הביטוי של מספר רב של גנים, כולל גנים עבור סינתזה הריבוזומים וחומצות אמינו1,2. למרות שהתגלו בתחילה בשנת החיידק הקולי3, (p) ppgpp ניתן למצוא הן בקטריה גראם חיוביים גראם שליליים, כמו גם במפעל כלורפור4,5. עבור E. coli וחיידקים גראם שליליים אחרים, (p) ppgpp אינטראקציה ישירה עם RNA פולימראז בשני אתרים שונים6,7,8. ב גראם חיוביים, (p) ppgpp מעכב gtp שפע, אשר חש על ידי קודי, מחייב gtp חלבון עם מוטיבים לזיהוי דנ א ספציפי גנטי שמוביל תקנה9,10. (p) ppgpp מצטבר בתגובה לרעב עבור חומרים מזינים שונים ותנאי סטרס, וכתוצאה מכך צמיחה איטית והתאמות של ביטוי גנים כדי לאפשר הסתגלות לחץ11,12.
כמות הנטו של ppGpp שנצבר משקפת איזון בין חומרים הידרוקלז לבין פעילויות. ב -E. coli לה היא הבורסה החזקה, והנקודה היא ביותפקודית, עם הידרולז חזק ומגוון של הבורסה החלשה, שכל אחד מהם עשוי להיות מוסדר בצורה שונה באופן תלוי בלחץ. הבורסה החזקה ביותר מופעלת כאשר הזמינות של codon מחויב trna הטעונה לאתר הריבוזומבית כאשר הוא לא מצליח לעמוד בדרישות של סינתזה חלבון13,14,15. כתם חלש (p) ppGpp חומרים הבורסה מופעלת בעוד חזקה (p) ppGpp הידרולז הוא מעוכב בתגובה לתנאי לחץ אחרים דרך מנגנונים אחרים. בתנאים מסוימים, חלבונים כגון ACP או rsd יכול לאגד לספוט, אשר גם לשנות את האיזון בין הידרוליזה וסינתזה16,17. ב גראם תוצאות חיוביות, סינתזה והידרוליזה משקפים איזון מורכב יותר בין החלבון ההומובית היחיד של לה ספוט (RSH) עם סינתזה חזקה ופעילויות הידרוליזה, כמו גם הידרוליסים קטנים ו/או חומרים מטעים12.
The (p) ונוקלאוטידים התגלו לראשונה כמו יוצא דופן 32p המסומנים כתמים הופיעו על אדיגרמות אוטומטית של כרומטוגרמות דק שכבה (חום) במהלך התגובה המחמירים הנגרמת על ידי חומצה אמינית הרעבה3. פרוטוקולים תיוג מפורט יותר נבדקו 18. הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1) הוא שינוי של הפרוטוקולים הללו המאפשר בניטור הצמיחה של דגימות מרובות על צלחות microtiter. זה מקל על הערכות ביולוגיות וטכניות מרובות של (p) שינויי שפע ppGpp ופותחה בתחילה למחקרים של משמרות diauxic19. התוויות של (p) ppGpp עם 32p וזיהוי על ידי ומאפשר גם מדידות של (p) שיעורי השפלה ppGpp. שיטות חלופיות פותחו כדי לקבוע (p) רמות ppGpp כגון ספקטרומטר המוני, מיטובי20, כימוטוחיישנים פלורסנט21,22, ו-gfp גן Fusions ליזמים המושפעים על ידי ppgpp23, 24. כימוחיישנים פלורסנט כרגע יש שימוש מוגבל בשל משמרות ספקטרליות קטנות לאחר הכריכה ppgpp, כמו גם בעיות ההבחנה בין ppgpp ו pppGpp21. שיטה זו יעילה כדי לזהות (p) ppGpp ב מבחנה, אבל לא בתמציות הסלולר. שיטות הקשורות לשיטות שופרו ב-20 אך דורשות ציוד יקר ואינן מותאם היטב לרמה גבוהה. לבסוף, GFP fusions יכול לתת הערכה של הפעלה תלויה ppGpp או עיכוב, אבל לא למדוד ppGpp עצמו. בעוד כל אחת השיטות החלופיות הללו הם יקרי ערך, הם דורשים ציוד יקר או הידיים בזמן משמעותי, או שהם בדרך כלל לא קלה לדגימה קינטית מרובים עיבוד הבאים. עם השיטה המתוארת כאן, ניתן להחיל דגימות של 96 על שש צלחות ה-לחות ב-20 דקות (18 דגימות לצלחת), שנפתרה על-ידי התפתחות הפיתוח בפחות מכמה שעות, עם נתונים כמותיים שהתקבלו לאחר מספר שעות או לילה, בהתאם לתיוג עוצמה.
השגת התווית האחידה של התאים היא צעד קריטי עבור פרוטוקול זה. לפיכך, השימוש במדיה מוגדרת, כגון מדיה מסוג מגבים או טריס, הינו חיוני כדי לאפשר וריאציה של ריכוזי פוספט לנושא ופעילות מסוימת. אין אפשרות להשתמש באמצעי מדיה מואגור פוספט, כגון M9 או מדיה A. רוב המדיה הלא מוגדרת מכילה כמויות משתנים של פו…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה היה נתמך בתוכנית מחקר הפנים, יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, NIH.
(NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
Glucose | Macron | 4912-12 | |
H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
L-Valine | Sigma | V-6504 | |
MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Thiamine | Sigma | T-4625 | |
TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |