Usando microtiter prato Radiolabeling para múltiplo in vivo medições de Escherichia coli (p) ppGpp seguido por cromatografia em camada fina
Summary
O crescimento de culturas bacterianas radiolabeled em pratos do de microtitulação facilita a amostragem elevada da taxa de transferência que permite testes técnicos e biológicos múltiplos da repetição da abundância da associação do nucleotide, incluindo aquele de (p) ppgpp. Os efeitos das transições de crescimento provocados por fontes de estresse fisiológico, bem como a recuperação do estresse podem ser monitorados.
Abstract
O nucleotídeo (p) ppGpp funciona como um regulador global em bactérias em resposta a uma variedade de estresse físico e nutricional. Tem um início rápido, em segundos, o que leva ao acúmulo de níveis que se aproximam ou excedem os de pools de GTP. Ocasiões de reversão de estresse um rápido desaparecimento de (p) ppGpp, muitas vezes com uma meia-vida de menos de um minuto. A presença de (p) ppGpp resulta em alterações da expressão gênica celular e do metabolismo que contrariam os efeitos nocivos do estresse. As bactérias Gram-negativas e Gram-positivas têm diferentes mecanismos de resposta, mas ambas dependem da (p) concentração de ppGpp. Em todo o caso, há uma necessidade de monitorar simultaneamente muitas culturas bacterianas radioolabeled em intervalos de tempo que podem variar de 10 segundos às horas durante períodos críticos da transição do esforço. Este protocolo aborda este desafio técnico. O método aproveita-se das incubadoras do prato da temperatura-e do Shaker-controlled do de microtitulação que permitem a monitoração paralela do crescimento (absorvância) e a amostragem rápida de culturas uniformemente fosfato-radiolabeled para resolver e quantificar associações do nucleotide por cromatografia em camada delgada em PEI-celulose. Pequenas quantidades de amostra são necessárias para múltiplas repetições técnicas e biológicas de análises. As transições complexas de crescimento, como o crescimento diauxico e as taxas de rotatividade rápida (p) ppGpp, podem ser avaliadas quantitativamente por esse método.
Introduction
O (p) ppgpp segundo mensageiro é um regulador global que modula a expressão de um grande número de genes, incluindo genes para sintetizar ribossomas e aminoácidos1,2. Embora inicialmente descoberto em Escherichia coli3, (p) ppgpp pode ser encontrado em bactérias gram positivas e Gram negativas, bem como em clorotipados de plantas4,5. Para e . coli e outras bactérias Gram-negativas, (p) ppgpp interage diretamente com a RNA polimerase em dois sítios diferentes6,7,8. Em gram positivos, (p) ppgpp inibe a abundância de GTP, que é detectado por CodY, uma proteína de ligação de GTP com motivos de reconhecimento de DNA específicos do gene que levam à regulação9,10. (p) o ppgpp se acumula em resposta à inanição por diferentes nutrientes e condições de estresse, resultando em crescimento lento e ajustes da expressão gênica para permitir a adaptação ao estresse11,12.
A quantidade líquida de ppgpp acumulada reflecte um equilíbrio entre as actividades da sintetase e da hidrolase. Em e. coli RelA é uma forte sintetase e mancha é bifuncional, com uma forte hidlase e uma sintetase fraca, cada uma das quais pode ser regulada de forma diferente de forma dependente do stress. A forte relação sintetase é ativada quando a disponibilidade de Codon-especificado cobrado tRNA vinculado ao ribossomal um site quando ele não consegue acompanhar as demandas de síntese protéica13,14,15. O ponto fraco (p) ppgpp sintetase é ativado enquanto a forte (p) ppgpp hidrolase é inibida em resposta a outras condições de estresse e através de outros mecanismos. algumas condições, proteínas como ACP ou RSD podem se vincular ao ponto, o que também altera o equilíbrio entre a hidrólise e a síntese16,17. Em gram positivos, a síntese e a hidrólise refletem um equilíbrio mais complexo entre uma única proteína do homólogo do ponto de RelA (RSH) com atividades fortes da síntese e da hidrólise assim como hidrolases e/ou sintetases menores12.
Os nucleotídeos de (p) ppgpp foram descobertos primeiramente como os pontos 32p etiquetados incomuns que apareceram em autoradiograms de cromatogramas da fino-camada (TLC) durante uma resposta estrita induzida pela inanição do ácido aminado3. Os protocolos de rotulagem mais detalhados foram revistos 18. O protocolo descrito aqui (Figura 1) é uma modificação desses protocolos que permite o monitoramento do crescimento de múltiplas amostras em placas de de microtitulação. Isso facilita múltiplas estimativas biológicas e técnicas de (p) alterações na abundância de ppGpp e foi inicialmente desenvolvida para estudos de turnos diauxínicos19. A rotulagem de (p) ppGpp com 32p e detecção por TLC também permite medições de (p) taxas de degradação de ppgpp. Métodos alternativos foram desenvolvidos para determinar os níveis de ppGpp (p) como espectrometria de massas, HPLC20, quimiosensoresfluorescentes 21,22e fusões de genes GFP a promotores afetados pelo ppgpp23, os quimiosensores 24. fluorescentes têm atualmente um uso limitado devido a deslocamentos espectrais pequenos após o ppgpp obrigatório assim como os problemas que distinguem entre ppgpp e pppgpp21. Este método é eficiente para detectar (p) ppGpp in vitro, mas não em extratos celulares. Os métodos que envolvem HPLC foram melhorados20 mas exigem o equipamento caro e não são adaptados bem ao elevado-põr. Finalmente, as fusões de GFP podem dar uma estimativa da ativação ou da inibição dependente do ppGpp, mas não medem o próprio ppGpp. Quando cada um destes métodos alternativos for valioso, exigem o equipamento caro ou o tempo hands-on substancial, ou são de outra maneira não passíveis à amostragem cinética múltipla e ao processamento subseqüente. Com o método descrito aqui, 96 amostras podem ser aplicadas a seis placas TLC em cerca de 20 min (18 amostras por placa), resolvidas pelo desenvolvimento de TLC em menos de um par de horas, com dados quantitativos obtidos após várias horas ou durante a noite, dependendo da rotulagem Intensidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conseguir a rotulagem uniforme próxima das pilhas é uma etapa crítica para este protocolo. Portanto, o uso de meios de comunicação definidos, como MOPS ou Tris, é crucial para permitir a variação das concentrações de fosfato de portador e atividade específica. A mídia tamponada por fosfato, como M9 ou mídia A, não pode ser usada. A maioria dos meios indefinidos contêm quantidades variáveis de fosfato, tais como LB, triptona e ácidos casamino. O isótopo de fosfato 33p é um emissor mais fraco …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada o programa de pesquisa intramural, Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde da criança e desenvolvimento humano, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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