Veksten av radiolabeled bakteriell kulturen inne mikrotiterbrønnene fat Letter høy produksjon prøving det innrømmer mangfoldig teknisk og Biological duplisere analyser av nukleotid basseng overflod, inkluderer det av (pencen) ppGpp. Effektene av vekst overganger provosert av kilder til fysiologisk stress, samt utvinning fra stress kan overvåkes.
The (p) ppGpp nukleotid fungerer som en global regulator i bakterier som svar på en rekke fysiske og ernæringsmessige stress. Den har en rask debut, i sekunder, noe som fører til opphopning av nivåer som nærmer eller overskrider de av GTP bassenger. Stress reversering anledninger en rask forsvinningen av (p) ppGpp, ofte med en halveringstid på mindre enn et minutt. Tilstedeværelsen av (p) ppGpp resulterer i endringer av cellulære genuttrykk og metabolisme som motvirke de skadelige virkningene av stress. Gram-negative og gram-positive bakterier har forskjellige reaksjons mekanismer, men begge avhenger av (p) ppGpp konsentrasjon. I alle tilfelle, det er en nød å samtidig dataskjerm mange radiolabeled bakteriell kulturen for tid intervaller det kanskje variere fra 10 sekunder å timene i løpet av betenkelig trykk overgang perioder. Denne protokollen løser denne tekniske utfordringen. Metoden utnytter temperatur-og shaker-kontrollerte mikrotiterbrønnene parabolen inkubatorer som tillater parallell overvåking av vekst (absorbansen) og rask prøvetaking av jevnt fosfat-radiolabeled kulturer å løse og quantitate nukleotid bassenger ved tynt lag kromatografi på PEI-cellulose. Små mengder utvalg er nødvendig for flere tekniske og biologiske replikerer av analyser. Komplekse vekst overganger, slik som diauxic vekst og rask (p) ppGpp omløpshastighet kan kvantitativt vurderes av denne metoden.
The (p) ppGpp andre Messenger er en global regulator som modulerer uttrykk for et stort antall gener, inkludert gener for syntetisere ribosomer og aminosyrer1,2. Selv om utgangspunktet oppdaget i Escherichia coli3, (p) ppGpp kan finnes i både gram positive og gram negative bakterier så vel som i anlegget Chloroplasts4,5. For E. coli og andre gram-negative bakterier, (p) ppGpp samhandler direkte med RNA polymerase på to forskjellige steder6,7,8. I gram positiver, (p) ppGpp hemmer GTP overflod, som er følt av CodY, en GTP-bindende protein med Gen-spesifikke DNA-anerkjennelse motiver som fører til regulering9,10. (p) ppGpp akkumuleres som svar på sult for ulike næringsstoffer og stress forhold, noe som resulterer i langsom vekst og justeringer av genet uttrykk for å tillate tilpasning til stress11,12.
Nettobeløpet for ppGpp akkumulert reflekterer en balanse mellom syntetase og Hydrolase aktiviteter. I E. coli forholdet er en sterk Syntetase og SpoT er bifunctional, med en sterk Hydrolase og en svak syntetase, som hver kan være regulert forskjellig i en stress avhengig måte. Den sterke forholdet syntetase aktiveres når tilgjengeligheten av Codon-spesifiserte ladet tRNA bundet til ribosomal et område når den ikke klarer å holde tritt med kravene til proteinsyntese13,14,15. Det svake punktet (p) ppGpp-syntetase aktiveres mens den sterke (p) ppGpp-Hydrolase blir hemmet som følge av andre stress forhold og gjennom andre mekanismer. Under noen forhold kan proteiner som ACP eller RSD bindes til SpoT, som også endrer balansen mellom hydrolyse og syntese16,17. I gram positiver reflekterer syntese og hydrolyse en mer kompleks balanse mellom et enkelt forholdet SpoT homologe (RSH) protein med sterk syntese og hydrolyse aktiviteter så vel som mindre hydrolases og/eller synthetases12.
The (p) ppGpp nukleotider ble først oppdaget som uvanlige 32p merket flekker som dukket opp på autoradiograms av tynne-lags KROMATOGRAMMENE (TLC) under en streng respons indusert av aminosyre sult3. Mer detaljerte merking protokoller har gjennomgått 18. Protokollen som beskrives her (figur 1) er en modifikasjon av disse protokollene som gjør det mulig å overvåke vekst av flere prøver på mikrotiterbrønnene plater. Dette forenkler flere biologiske og tekniske anslag over (p) ppGpp overflod endringer og ble opprinnelig utviklet for studier av diauxic Skift19. Merking av (p) ppGpp med 32p og deteksjon av TLC tillater også målinger av (p) ppGpp ned brytnings rater. Alternative metoder er utviklet for å bestemme (p) ppGpp nivåer som masse massespektrometri, HPLC20, fluorescerende chemosensors21,22, og GFP gen fusjoner til arrangører berørt av ppGpp23, 24. fluorescerende chemosensors for tiden har en begrenset bruk på grunn av små Spectral Skift etter binding ppGpp samt problemer skille mellom PpGpp og pppGpp21. Denne metoden er effektiv for å oppdage (p) ppGpp in vitro, men ikke i cellulære ekstrakter. Metoder som involverer HPLC har blitt forbedret20 , men krever dyrt utstyr og er ikke godt tilpasset til høy gjennom-PUT. Til slutt kan GFP fusjoner gi et anslag på ppGpp avhengig aktivering eller hemming, men ikke måle ppGpp selv. Mens hver av disse alternative metoder er verdifulle, de krever dyrt utstyr eller betydelig hands-on tid, eller de er ellers ikke mottagelig for flere kinetisk prøvetaking og påfølgende prosessering. Med metoden beskrevet her, 96 prøver kan brukes på seks TLC plater i ca 20 min (18 prøver per plate), løst av TLC utvikling på mindre enn et par timer, med kvantitative data innhentet etter flere timer eller over natten, avhengig av merking Intensitet.
Å oppnå nær uniform merking av cellene er et kritisk trinn for denne protokollen. Derfor er bruken av definerte medier, for eksempel MOPPER eller Tris Media, avgjørende for å muliggjøre variasjon av fosfat konsentrasjoner av bærebølge og spesifikk aktivitet. Fosfat-bufrede medier, for eksempel M9 eller Media A, kan ikke brukes. De fleste udefinert medier inneholder variable mengder fosfat, slik som LB, tryptone og casamino syrer. Den fosfat isotop 33p er en svakere emitter som kan erstatte 32</sup…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet intramural Research program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child helse og Human Development, NIH.
(NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
Glucose | Macron | 4912-12 | |
H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
L-Valine | Sigma | V-6504 | |
MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Thiamine | Sigma | T-4625 | |
TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |