استخدام الميكروتيدر طبق الوسم الإشعاعي لقياسات متعددة في الجسم من الإشريكية القولونية (ع) ppGpp تليها طبقة رقيقة اللوني
Summary
نمو الثقافات البكتيرية ذات العلامات الإشعاعية في أطباق ميكروتيدر يسهل أخذ العينات الإنتاجية العالية التي تسمح اختبارات تكرار متعددة التقنية والبيولوجية من وفرة تجمع النيوكليوتيد، بما في ذلك أن (ع) ppGpp. ويمكن رصد آثار تحولات النمو الناجمة عن مصادر الإجهاد الفسيولوجي وكذلك الانتعاش من الإجهاد.
Abstract
يعمل النيوكليوتيد (p)pppp كمنظم عالمي في البكتيريا استجابة لمجموعة متنوعة من الإجهاد البدني والتغذوي. فقد بداية سريعة، في ثوان، مما يؤدي إلى تراكم المستويات التي تقترب أو تتجاوز تلك برك GTP. عكس الإجهاد مناسبات اختفاء سريع من (ع) ppGpp، في كثير من الأحيان مع نصف عمر أقل من دقيقة. وجود (ع) ppGpp يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني الخلوي والتمثيل الغذائي التي تتصدى للآثار الضارة للإجهاد. البكتيريا السالبة للجرام وإيجابية الجرام لها آليات استجابة مختلفة، ولكن كلاهما يعتمد على تركيز (p)ppGpp. وعلى أية حال، هناك حاجة إلى مراقبة العديد من الثقافات البكتيرية ذات العلامات الإشعاعية في وقت واحد على فترات زمنية قد تختلف من 10 ثوان إلى ساعات خلال فترات انتقال الإجهاد الحرجة. ويعالج هذا البروتوكول هذا التحدي التقني. وتستفيد هذه الطريقة من حاضنات الأطباق الميكروتيتر التي تسيطر عليها درجة الحرارة والهزاز التي تسمح بالرصد الموازي للنمو (الامتصاص) وأخذ العينات السريعة من الثقافات ذات العلامات الإشعاعية الموحدة للفوسفات لحل وكمية برك النيوكليوتيدات عن طريق طبقة رقيقة من اللوني على جزيرة الأمير إدوارد السليلوز. وهناك حاجة إلى كميات صغيرة من العينات لإجراء نسخ تقني وبيولوجي متعدد للتحليلات. ويمكن تقييم التحولات المعقدة في النمو، مثل النمو الديوليك ومعدلات دوران الـ ppG(pp) السريعة من الناحية الكمية بهذه الطريقة.
Introduction
و (ع) ppGpp رسول الثاني هو منظم العالمية التي تعدل التعبير عن عدد كبير من الجينات، بما في ذلك الجينات لتوليف الريبوسوم والأحماض الأمينية1،2. على الرغم من اكتشافها في البداية في الإشريكيةالقولونية3، (ع) ppGpp يمكن العثور عليها في كل من البكتيريا إيجابية غرام وغرام السلبية وكذلك في الكلوروبلاست النبات4،5. بالنسبة للكولاي والبكتيريا السلبية الجرام الأخرى، (ع)ppGpp يتفاعل مباشرة مع بوليميراز RNA في موقعين مختلفين6و7و8. في إيجابيات غرام، (ع) ppGpp يمنع وفرة GTP، الذي يشعر به CodY، وهو بروتين GTP ملزمةمع زخارف التعرف الحمض النووي محددة الجينات التي تؤدي إلى اللائحة 9،10. (ع)ppGpp يتراكم استجابة لتجويع لمختلف المواد الغذائية وظروف الإجهاد، مما أدى إلى بطء النمو والتعديلات في التعبير الجيني للسماح التكيف مع الإجهاد11،12.
ويعكس المبلغ الصافي للجزء المتراكم من الـ ppgpp التوازن بين أنشطة السينثتاز والزراعة المائية. في E. القولونية RelA هو synthetase قوية وSpoT ثنائية الوظائف، مع هيدرولاز قوية وsynthetase ضعيفة، كل منها قد تنظم بشكل مختلف بطريقة تعتمد على الإجهاد. يتم تنشيط synthetase RelA قوية عندما توافر codon-specified اتهم tRNA ملزمة لموقع ريبوسومال A عندما يفشل في مواكبة متطلبات تخليق البروتين13,14,15. يتم تنشيط SpoT ضعيفة (ع) ppGpp synthetase في حين أن قوية (ع) ppPp hydrolase يتم تثبيط استجابة لظروف الإجهاد الأخرى ومن خلال آليات أخرى. في بعض الظروف، يمكن ربط البروتينات مثل ACP أو Rsd إلى SpoT، والتي تغير أيضا التوازن بين التحلل المائي والتوليف16،17. في إيجابيات غرام, التوليف والتحلل المائي تعكس توازنا أكثر تعقيدا بين واحد RelA SpoT التجانس (RSH) البروتين مع تخليق قوي وأنشطة التحلل المائي، فضلا عن الهيدرولاس أصغر و / أو synthetases12.
تم اكتشاف النيوكليوتيدات (ع) ppGpp لأول مرة على أنها غير عادية 32P وصفت البقع التي ظهرت على autoradiograms من طبقة رقيقة من الكروماtoغرام (TLC) خلال استجابة صارمة الناجمة عن تجويع الأحماض الأمينية3. تم استعراض بروتوكولات وضع العلامات الأكثر تفصيلاً 18. البروتوكول الموصوف هنا (الشكل 1) هو تعديل لهذه البروتوكولات التي تسمح برصد نمو عينات متعددة على لوحات ميكروتيدر. وهذا يسهل التقديرات البيولوجية والتقنية المتعددة للتغيرات وفرة ppGpp وقد وضعت في البداية لدراسات التحولات ثنائي ة19. كما يسمح وضع العلامات على (ع) ppGpp مع 32P والكشف عن طريق TLC قياسات (ع) معدلات التحلل ppGpp. وقد وضعت أساليب بديلة لتحديد (ع) مستويات ppGpp مثل قياس الطيف الكتلي، HPLC20،أجهزة الاستشعار الكيميائية الفلورسنت21،22،وGFP الانصهارات الجينية للمروّجين المتضررين من ppGpp23، 24.أجهزة الاستشعار الكيميائية الفلورسنت لديها حاليا استخدام محدود بسبب التحولات الطيفية الصغيرة بعد ربط ppGpp وكذلك المشاكل التي تميز بين ppGpp وpppGpp21. هذه الطريقة هي فعالة للكشف عن (ع) ppGpp في المختبر، ولكن ليس في مقتطفات الخلوية. وقد تم تحسين الأساليب التي تنطوي على HPLC20 ولكن تتطلب معدات باهظة الثمن وغير مكيفة بشكل جيد لعالية من خلال وضع. وأخيرا، يمكن أن تعطي الانصهارGFG تقديرا للتنشيط تعتمد ppGpp أو تثبيط، ولكن لا تقيس ppGpp نفسها. وفي حين أن كل طريقة من هذه الطرق البديلة قيمة، فإنها تتطلب معدات باهظة الثمن أو معدات عملية كبيرة في الوقت المحدد، أو أنها غير قابلة لأخذ العينات الحركية المتعددة والمعالجة اللاحقة. مع الطريقة الموضحة هنا، يمكن تطبيق 96 عينة على ست لوحات TLC في حوالي 20 دقيقة (18 عينة لكل لوحة)، حلها عن طريق تطوير TLC في أقل من بضع ساعات، مع البيانات الكمية التي تم الحصول عليها بعد عدة ساعات أو بين عشية وضحاها، اعتمادا على وضع العلامات كثافه.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحقيق وضع العلامات شبه موحدة من الخلايا هو خطوة حاسمة لهذا البروتوكول. ولذلك، فإن استخدام وسائط محددة، مثل وسائط الوسائط الخاصة بوزارة الأشغال العامة أو وسائط Tris، أمر بالغ الأهمية للسماح بتباين تركيزات الفوسفات الناقل ونشاط محدد. لا يمكن استخدام الوسائط المخزنة بالفوسفات، مثل M9 أو الوسا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث في برنامج البحوث داخل الجدارية، معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، المعاهد القومية للصحة.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
Riferimenti
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
