Anvendelse af Mikrotiterparabol Radiolabeling til flere in vivo-målinger af Escherichia coli (p) ppGpp efterfulgt af Tyndtlagkromatografi
Summary
Væksten af radioaktivt mærkede bakterielle kulturer i mikrotiterretter letter høj gennemløb prøvetagning, der giver mulighed for flere tekniske og biologiske replikat analyser af nukleotid pool overflod, herunder af (p) ppGpp. Virkningerne af vækst overgange fremkaldt af kilder til fysiologisk stress samt genopretning efter stress kan overvåges.
Abstract
Den (p) ppGpp nucleotid fungerer som en global regulator i bakterier som reaktion på en række fysiske og ernæringsmæssige stress. Det har en hurtig debut, i sekunder, hvilket fører til ophobning af niveauer, der nærmer sig eller overstiger dem af GTP puljer. Stress vending lejligheder en hurtig forsvinden af (p) ppGpp, ofte med en halveringstid på mindre end et minut. Tilstedeværelsen af (p) ppGpp resulterer i ændringer af cellulære genekspression og metabolisme, der modvirker de skadelige virkninger af stress. Gram-negative og gram-positive bakterier har forskellige responsmekanismer, men begge afhænger af (p) ppGpp koncentration. Under alle omstændigheder er der et behov for samtidig at overvåge mange radioaktivt mærkede bakterielle kulturer med tidsintervaller, der kan variere fra 10 sekunder til timer i kritiske stress overgangsperioder. Denne protokol omhandler denne tekniske udfordring. Metoden udnytter temperatur-og shaker-kontrollerede mikrotiterparabol inkubatorer, der muliggør parallel overvågning af vækst (absorbans) og hurtig prøvetagning af ensartet fosfat-radioaktivt mærkede kulturer for at løse og kvantificere nukleotidpuljer ved tyndtlagskromatografi på PEI-cellulose. Der kræves små mængder prøve til flere tekniske og biologiske replikater af analyser. Komplekse vækst overgange, såsom diauxic Growth og Rapid (p) ppGpp omsætnings rater kan kvantitativt vurderes ved denne metode.
Introduction
Den (p) ppgpp anden Messenger er en global regulator, der modulerer ekspression af et stort antal gener, herunder gener for syntetisere ribosomer og aminosyrer1,2. Selv om det oprindeligt blev opdaget i Escherichia coli3, (p) ppgpp kan findes i både grampositive og gramnegative bakterier samt i plante chloroplaster4,5. For E. coli og andre gram-negative bakterier, (p) ppgpp interagerer direkte med RNA polymerase på to forskellige steder6,7,8. I gram positiver, (p) ppgpp hæmmer GTP overflod, som er fornemmede af CodY, en GTP-binding protein med gen-specifikke DNA-genkendelse motiver, der fører til regel9,10. p) ppgpp akkumuleres som reaktion på hungersnød for forskellige næringsstoffer og stressforhold, hvilket resulterer i langsom vækst og justeringer af genekspression for at muliggøre tilpasning til stress11,12.
Nettomængden af akkumuleret ppGpp afspejler en balance mellem syntetase-og hydrolase aktiviteter. I E. coli RelA er en stærk syntetase og SpoT er bifunktionel, med en stærk hydrolase og en svag syntetase, som hver især kan reguleres forskelligt på en stress afhængig måde. Den stærke RelA-syntetase aktiveres, når tilgængeligheden af codon-specificerede ladede tRNA bundet til ribosomale et sted, når det undlader at holde trit med kravene i proteinsyntese13,14,15. Den svage SpoT (p) ppgpp syntetase er aktiveret, mens den stærke (p) ppgpp hydrolase er hæmmet som reaktion på andre stress betingelser og gennem andre mekanismer. Under visse omstændigheder kan proteiner som ACP eller RSD binde sig til SpoT, hvilket også ændrer balancen mellem hydrolyse og syntese16,17. I gram positiver afspejler syntese og hydrolyse en mere kompleks balance mellem et enkelt RelA SpoT ligner (rsh) protein med stærke syntese-og hydrolyse aktiviteter samt mindre hydrolaser og/eller synthetaser12.
(P) ppgpp nukleotider blev først opdaget som usædvanlige 32p mærkede pletter, der dukkede op på autoradiogrammer af tyndtlagkromatogrammer (TLC) under en streng respons induceret af aminosyre sult3. Mere detaljerede mærknings protokoller er blevet anmeldt 18. Den protokol, der er beskrevet her (figur 1), er en ændring af disse protokoller, som gør det muligt at overvåge væksten af flere prøver på mikrotiterplader. Dette letter flere biologiske og tekniske skøn over (p) ppGpp overflod ændringer og blev oprindeligt udviklet til studier af diauxic Skift19. Mærkning af (p) ppGpp med 32p og påvisning af TLC muliggør også målinger af (p) ppgpp-nedbrydnings rater. Alternative metoder er blevet udviklet til at bestemme (p) ppGpp-niveauer såsom massespektrometri, HPLC20, fluorescerende kemo sensorer21,22og gfp-genfusioner til initiativtagere, som berøres af ppgpp23, 24. fluorescerende kemo sensorer har i øjeblikket begrænset brug på grund af små spektral forskydninger efter binding af ppgpp samt problemer med at skelne mellem ppgpp og pppgpp21. Denne metode er effektiv til at opdage (p) ppGpp in vitro, men ikke i cellulære ekstrakter. Metoder, der involverer HPLC er blevet forbedret20 men kræver dyrt udstyr og er ikke godt tilpasset til høj gennem-Put. Endelig kan GFP-fusioner give et estimat af ppGpp-afhængig aktivering eller hæmning, men måler ikke ppGpp selv. Mens hver af disse alternative metoder er værdifulde, de kræver dyrt udstyr eller betydelig hands-on tid, eller de er ellers ikke modtagelig for flere kinetiske prøvetagning og efterfølgende behandling. Med den metode, der er beskrevet her, kan 96 prøver anvendes på seks TLC-plader i ca. 20 minutter (18 prøver pr. plade), løst ved TLC-udvikling på mindre end et par timer, med kvantitative data opnået efter flere timer eller natten, afhængigt af mærkning Intensitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Opnåelse nær ensartet mærkning af cellerne er et afgørende skridt for denne protokol. Derfor er brugen af definerede medier, såsom MOPS eller Tris Media, afgørende for at muliggøre variation af bærers fosfat koncentrationer og specifik aktivitet. Fosfat bufferet medie, såsom M9 eller Media A, kan ikke bruges. De fleste udefineret medier indeholder variable mængder fosfat, såsom LB, trypton og casamino syrer. Fosfat isotop 33p er en svagere udleder, der kan erstattes af 32p. fordelene ved …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet Intramural Research program, Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health og Human Development, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
Riferimenti
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
