Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie
Summary
De groei van van bacteriële culturen in micro titer gerechten vergemakkelijkt een hoge doorvoer bemonstering die meerdere technische en biologische repliceren assays van nucleotide zwembad overvloed, met inbegrip van die van (p) ppgpp. De effecten van groei overgangen veroorzaakt door bronnen van fysiologische stress en herstel van stress kunnen worden gecontroleerd.
Abstract
De (p) ppGpp nucleotide fungeert als een wereldwijde regulator in bacteriën in reactie op een verscheidenheid van fysieke en voedings stress. Het heeft een snel begin, in seconden, wat leidt tot accumulatie van niveaus die benaderen of overtreffen die van GTP Pools. Stress omkering gevallen een snelle verdwijning van (p) ppGpp, vaak met een halveringstijd van minder dan een minuut. De aanwezigheid van (p) ppGpp resulteert in veranderingen van cellulaire genexpressie en metabolisme die de schadelijke effecten van stress tegengaan. Gram-negatieve en gram-positieve bacteriën hebben verschillende responsmechanismen, maar beide zijn afhankelijk van (p) ppGpp concentratie. In elk geval is het noodzakelijk om tegelijkertijd veel radioolabeled bacteriële culturen te controleren op tijdsintervallen die kunnen variëren van 10 seconden tot uren tijdens kritieke stress overgangsperioden. Dit protocol behandelt deze technische uitdaging. De methode maakt gebruik van de temperatuur-en Shaker-gestuurde micro titer schotel incubatoren die parallelle monitoring van de groei (extinctie) en snelle bemonstering van gelijkmatig fosfaat-radiolabeled culturen op te lossen en kwantificeren nucleotide Pools door Dunnelaagchromatografie op PEI-cellulose. Kleine hoeveelheden monster zijn nodig voor meerdere technische en biologische replicaties van analyses. Complexe groei overgangen, zoals diauxische groei en snelle (p) ppGpp-omzet percentages kunnen met deze methode kwantitatief worden beoordeeld.
Introduction
De (p) ppgpp tweede boodschapper is een wereldwijde regulator die de uitdrukking van een groot aantal genen moduleert, inclusief genen voor het synthetiseren van ribosomomen en aminozuren1,2. Hoewel aanvankelijk ontdekt in Escherichia coli3, (p) ppgpp kan worden gevonden in zowel grampositieve en gram negatieve bacteriën, alsmede in plantaardige chloroplasten4,5. Voor E. coli en andere gram-negatieve bacteriën, (p) ppgpp communiceert rechtstreeks met RNA polymerase op twee verschillende sites6,7,8. In gram positieven, (p) ppgpp remt de overvloed van GTP, die wordt gedetecteerd door CodY, een GTP-bindend eiwit met genen-specifieke DNA-herkennings motieven die leiden tot Regulation9,10. p) ppgpp hoopt zich op als reactie op de honger naar verschillende voedingsstoffen en stress condities, wat resulteert in langzame groei en aanpassingen van de genexpressie, omaanpassing aan stress mogelijk te maken.
Het nettobedrag van ppgpp geaccumuleerd weerspiegelt een evenwicht tussen stikstofoxidesynthetase en hydrolase activiteiten. In E. coli rela is een sterke stikstofoxidesynthetase en SpoT is bifunctioneel, met een sterke hydrolase en een zwakke stikstofoxidesynthetase, die elk kunnen verschillend worden gereguleerd in een stress afhankelijke manier. De sterke rela stikstofoxidesynthetase wordt geactiveerd wanneer de beschikbaarheid van codon-gespecificeerde tRNA gebonden aan het ribosomale een site als het niet voldoet aan de eisen van eiwitsynthese13,14,15. De zwakke plek (p) ppgpp stikstofoxidesynthetase wordt geactiveerd terwijl de sterke (p) ppgpp hydrolase wordt geremd in reactie op andere stress condities en via andere mechanismen. Onder bepaalde omstandigheden kunnen eiwitten zoals ACP of RSD binden aan SpoT, wat ook het evenwicht tussen hydrolyse en synthese16,17verandert. In gram positieven weerspiegelen synthese en hydrolyse een complexere balans tussen een enkele rela SpoT homo (rsh) eiwit met sterke synthese en hydrolyse activiteiten, evenals kleinere hydrolasen en/of synthetases12.
De (p) ppGpp nucleotiden werden voor het eerst ontdekt als ongewone 32p gelabelde vlekken die verschenen op autoradiogrammen van dunnelagige chromatogrammen (TLC) tijdens een strenge respons geïnduceerd door aminozuur honger3. Meer gedetailleerde labeling protocollen zijn beoordeeld 18. Het protocol dat hier wordt beschreven (Figuur 1) is een wijziging van deze protocollen waarmee de groei van meerdere monsters op microtiterplaten kan worden gecontroleerd. Dit vergemakkelijkt meerdere biologische en technische schattingen van (p) de overvloed aan ppGpp-veranderingen en werd aanvankelijk ontwikkeld voor studies naar diauxische verschuivingen19. Etikettering van (p) ppGpp met 32p en detectie door TLC maakt ook metingen van (p) ppgpp-afbraak percentages mogelijk. Er zijn alternatieve methoden ontwikkeld om (p) ppGpp-niveaus zoals massaspectrometrie, HPLC20, fluorescerende chemosensoren21,22en GFP-gen-fusies te bepalen voor de door ppgpp23 getroffen initiatiefnemers; 24. fluorescerende chemosensoren hebben momenteel een beperkt gebruik vanwege kleine spectrale verschuivingen na binding van ppgpp evenals problemen die onderscheid maken tussen ppgpp en pppgpp21. Deze methode is efficiënt om te detecteren (p) ppGpp in vitro, maar niet in cellulaire extracten. Methoden met betrekking tot HPLC zijn verbeterd20 maar vereisen dure apparatuur en zijn niet goed aangepast aan hoge door-put. Tot slot, GFP Fusions kan een schatting van ppGpp afhankelijke activering of remming te geven, maar niet meten ppGpp zelf. Hoewel elk van deze alternatieve methoden waardevol is, vereisen ze dure apparatuur of aanzienlijke hands-on tijd, of ze zijn anderszins niet vatbaar voor meerdere kinetische bemonstering en daaropvolgende verwerking. Met de hier beschreven methode kunnen 96 monsters worden toegepast op zes TLC-platen in ongeveer 20 minuten (18 samples per plaat), opgelost door TLC-ontwikkeling in minder dan een paar uur, met kwantitatieve gegevens verkregen na enkele uren of ‘s nachts, afhankelijk van het labelen Intensiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bereiken van de meest uniforme labeling van de cellen is een kritieke stap voor dit protocol. Daarom is het gebruik van gedefinieerde media, zoals MOPS of tris media, van cruciaal belang om variatie van de drager fosfaatconcentraties en specifieke activiteit mogelijk te maken. Fosfaat gebufferde media, zoals M9 of media A, kunnen niet worden gebruikt. De meeste ongedefinieerde media bevatten variabele hoeveelheden fosfaat, zoals lb, vorming en casamino zuren. De fosfaat-isotoop 33p is een zwakkere emitter …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en Human Development, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
Riferimenti
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
