באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה
Summary
התפתחותם של התרבויות החיידקי רדיויניום בצלחות microtiter מאפשר דגימת תפוקה גבוהה המאפשרת שכפול טכני וביולוגי מרובים מספר השפע של הבריכה נוקלאוטיד, כולל זה של (p) ppGpp. ההשפעות של מעברים צמיחה שעוררה מקורות של לחץ פיזיולוגי, כמו גם התאוששות מהלחץ ניתן לפקח.
Abstract
(P) הנוקלאוטיד ppGpp מתפקד כווסת גלובלי בחיידקים בתגובה למגוון רחב של מתח פיזי ותזונתי. יש לו התחלה מהירה, בשניות, אשר מוביל להצטברות של רמות הגישה או לחרוג אלה של בריכות GTP. היפוך מתח מקרים היעלמות מהירה של (p) ppGpp, לעתים קרובות עם מחצית חיים של פחות מדקה. הנוכחות של (p) ppGpp תוצאות שינויים של ביטוי גנים סלולריים ומטבוליזם המונה את ההשפעות המזיקות של מתח. גראם שליליים וחיידקים גראם חיוביים יש מנגנוני תגובה שונים, אבל שניהם תלויים (p) הריכוז ppGpp. בכל מקרה, יש צורך לנטר בו הרבה תרבויות בקטריאלי רדיויניום במרווחי זמן שעשויים להשתנות מ 10 שניות לשעות במהלך תקופות מעבר הלחץ הקריטי. פרוטוקול זה מטפל באתגר הטכני הזה. השיטה מנצלת חממות מבוקרת טמפרטורה ושייקר מבוקרים המאפשרים ניטור מקבילי של הצמיחה (ספיגה) ודגימה מהירה של תרבויות הפוספט האחיד והחד כדי לפתור ולכמת בריכות נוקלאוטיד כרומטוגרפיה בעלת שכבה דקה. בפיי-תאית כמויות קטנות של דגימה נחוצות עבור שכפול טכני וביולוגי מרובים של ניתוחים. מעברים צמיחה מורכבים, כגון הצמיחה diauxic ו מהירה (p) שיעורי המחזור ppGpp ניתן לכמת המוערך על ידי שיטה זו.
Introduction
השליח (p) ppgpp השני הוא מווסת גלובלי המודוללי את הביטוי של מספר רב של גנים, כולל גנים עבור סינתזה הריבוזומים וחומצות אמינו1,2. למרות שהתגלו בתחילה בשנת החיידק הקולי3, (p) ppgpp ניתן למצוא הן בקטריה גראם חיוביים גראם שליליים, כמו גם במפעל כלורפור4,5. עבור E. coli וחיידקים גראם שליליים אחרים, (p) ppgpp אינטראקציה ישירה עם RNA פולימראז בשני אתרים שונים6,7,8. ב גראם חיוביים, (p) ppgpp מעכב gtp שפע, אשר חש על ידי קודי, מחייב gtp חלבון עם מוטיבים לזיהוי דנ א ספציפי גנטי שמוביל תקנה9,10. (p) ppgpp מצטבר בתגובה לרעב עבור חומרים מזינים שונים ותנאי סטרס, וכתוצאה מכך צמיחה איטית והתאמות של ביטוי גנים כדי לאפשר הסתגלות לחץ11,12.
כמות הנטו של ppGpp שנצבר משקפת איזון בין חומרים הידרוקלז לבין פעילויות. ב -E. coli לה היא הבורסה החזקה, והנקודה היא ביותפקודית, עם הידרולז חזק ומגוון של הבורסה החלשה, שכל אחד מהם עשוי להיות מוסדר בצורה שונה באופן תלוי בלחץ. הבורסה החזקה ביותר מופעלת כאשר הזמינות של codon מחויב trna הטעונה לאתר הריבוזומבית כאשר הוא לא מצליח לעמוד בדרישות של סינתזה חלבון13,14,15. כתם חלש (p) ppGpp חומרים הבורסה מופעלת בעוד חזקה (p) ppGpp הידרולז הוא מעוכב בתגובה לתנאי לחץ אחרים דרך מנגנונים אחרים. בתנאים מסוימים, חלבונים כגון ACP או rsd יכול לאגד לספוט, אשר גם לשנות את האיזון בין הידרוליזה וסינתזה16,17. ב גראם תוצאות חיוביות, סינתזה והידרוליזה משקפים איזון מורכב יותר בין החלבון ההומובית היחיד של לה ספוט (RSH) עם סינתזה חזקה ופעילויות הידרוליזה, כמו גם הידרוליסים קטנים ו/או חומרים מטעים12.
The (p) ונוקלאוטידים התגלו לראשונה כמו יוצא דופן 32p המסומנים כתמים הופיעו על אדיגרמות אוטומטית של כרומטוגרמות דק שכבה (חום) במהלך התגובה המחמירים הנגרמת על ידי חומצה אמינית הרעבה3. פרוטוקולים תיוג מפורט יותר נבדקו 18. הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1) הוא שינוי של הפרוטוקולים הללו המאפשר בניטור הצמיחה של דגימות מרובות על צלחות microtiter. זה מקל על הערכות ביולוגיות וטכניות מרובות של (p) שינויי שפע ppGpp ופותחה בתחילה למחקרים של משמרות diauxic19. התוויות של (p) ppGpp עם 32p וזיהוי על ידי ומאפשר גם מדידות של (p) שיעורי השפלה ppGpp. שיטות חלופיות פותחו כדי לקבוע (p) רמות ppGpp כגון ספקטרומטר המוני, מיטובי20, כימוטוחיישנים פלורסנט21,22, ו-gfp גן Fusions ליזמים המושפעים על ידי ppgpp23, 24. כימוחיישנים פלורסנט כרגע יש שימוש מוגבל בשל משמרות ספקטרליות קטנות לאחר הכריכה ppgpp, כמו גם בעיות ההבחנה בין ppgpp ו pppGpp21. שיטה זו יעילה כדי לזהות (p) ppGpp ב מבחנה, אבל לא בתמציות הסלולר. שיטות הקשורות לשיטות שופרו ב-20 אך דורשות ציוד יקר ואינן מותאם היטב לרמה גבוהה. לבסוף, GFP fusions יכול לתת הערכה של הפעלה תלויה ppGpp או עיכוב, אבל לא למדוד ppGpp עצמו. בעוד כל אחת השיטות החלופיות הללו הם יקרי ערך, הם דורשים ציוד יקר או הידיים בזמן משמעותי, או שהם בדרך כלל לא קלה לדגימה קינטית מרובים עיבוד הבאים. עם השיטה המתוארת כאן, ניתן להחיל דגימות של 96 על שש צלחות ה-לחות ב-20 דקות (18 דגימות לצלחת), שנפתרה על-ידי התפתחות הפיתוח בפחות מכמה שעות, עם נתונים כמותיים שהתקבלו לאחר מספר שעות או לילה, בהתאם לתיוג עוצמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השגת התווית האחידה של התאים היא צעד קריטי עבור פרוטוקול זה. לפיכך, השימוש במדיה מוגדרת, כגון מדיה מסוג מגבים או טריס, הינו חיוני כדי לאפשר וריאציה של ריכוזי פוספט לנושא ופעילות מסוימת. אין אפשרות להשתמש באמצעי מדיה מואגור פוספט, כגון M9 או מדיה A. רוב המדיה הלא מוגדרת מכילה כמויות משתנים של פו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך בתוכנית מחקר הפנים, יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
Riferimenti
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
