Escherichia कोलाई (पी) ppGpp के कई में Vivo माप के लिए Microtiter डिश Radiolabeling का उपयोग पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया
Summary
microtiter व्यंजन में radiolabeled जीवाणु संस्कृतियों के विकास उच्च थ्रूपुट नमूना है कि न्यूक्लिओटाइड पूल बहुतायत के कई तकनीकी और जैविक प्रतिकृति assays की अनुमति देता है की सुविधा, की है कि (पी) ppGpp सहित. शारीरिक तनाव के स्रोतों के साथ-साथ तनाव से वसूली द्वारा उत्तेजित विकास संक्रमण के प्रभाव पर नजर रखी जा सकती है।
Abstract
(च) पीपीजीपी न्यूक्लिओटाइड विभिन्न प्रकार के शारीरिक और पोषण संबंधी तनाव के प्रत्युत्तर में बैक्टीरिया में एक वैश्विक नियामक के रूप में कार्य करता है। यह एक तेजी से शुरुआत है, सेकंड में, जो स्तर है कि दृष्टिकोण के संचय की ओर जाता है या GTP पूल के उन से अधिक है. तनाव उत्क्रमण अवसरों के एक तेजी से गायब (पी) ppGpp, अक्सर एक मिनट से भी कम समय के एक आधे जीवन के साथ. की उपस्थिति (पी) ppGpp सेलुलर जीन अभिव्यक्ति और चयापचय है कि तनाव के हानिकारक प्रभाव का मुकाबला के परिवर्तन में परिणाम. ग्राम-ऋणात्मक और ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में अलग-अलग प्रतिक्रिया तंत्र होते हैं, लेकिन दोनों (च) पीपीजीपी एकाग्रता पर निर्भर करते हैं। किसी भी घटना में, वहाँ एक साथ समय अंतराल है कि महत्वपूर्ण तनाव संक्रमण अवधि के दौरान घंटे के लिए 10 सेकंड से भिन्न हो सकते हैं पर कई radiolabeled जीवाणु संस्कृतियों की निगरानी की जरूरत है. यह प्रोटोकॉल इस तकनीकी चुनौती को संबोधित करता है. विधि तापमान का लाभ लेता है- और शेकर नियंत्रित microtiter पकवान इनक्यूबेटर कि विकास के समानांतर निगरानी की अनुमति (अवशोषण) और समान रूप से फॉस्फेट-radiolabeled संस्कृतियों के तेजी से नमूने को हल करने और मात्रात न्यूक्लिओटाइड पूल द्वारा पीई-सेलूलोज़ पर पतली परत क्रोमैटोग्राफी। विश्लेषण के कई तकनीकी और जैविक प्रतिकृति के लिए नमूने की छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है। जटिल विकास संक्रमण, जैसे कि डाइऑक्सिक वृद्धि और तेजी से (पी) पीपीजीपी कारोबार दरों को इस विधि द्वारा मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।
Introduction
(च) पीपीजीपी दूसरा दूत एक वैश्विक नियामक है जो राइबोसोम और एमिनो अम्ल1,2के संश्लेषित करने के लिए जीनों सहित बड़ी संख्या में जीनों की अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करता है। यद्यपि प्रारंभ में एस्चेरीचिया कोली3में खोज की गई थी , (च) पीपीजीपीपी ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया तथा पादप क्लोरोप्लास्ट4,5दोनों में पाया जा सकता है । ई. कोलाई और अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए, (च) पीपीजीपी दोअलग-अलग स्थलों 6,7,8पर आरएनए पॉलिमरेज के साथ सीधे सूचना का आदान-देना करता है। ग्राम पॉजीटिव्स में,(च) पीपीजीपी जी.टी.पी. बहुतायत को रोकता है, जिसे कोडी द्वारा महसूस किया जाता है, जीन-विशिष्ट डीएनए मान्यता रूपांकनों के साथ एक जीटीपी-बाध्यकारी प्रोटीन जो विनियमन9,10का नेतृत्व करता है। (च) पी.पी.जी.पी.पी. विभिन्न पोषक तत्वों और तनाव की स्थितियों के लिएभुखमरी के प्रत्युत्तर में जमा होता है, जिसके परिणामस्वरूप धीमी वृद्धि और जीन अभिव्यक्ति का समायोजन होता है जिससे अनुकूलन 11,12पर दबाव डालसकत है।
ppGpp संचित की शुद्ध राशि synthetase और hydrolase गतिविधियों के बीच एक संतुलन को दर्शाता है. ई. कोलाई RelA में एक मजबूत synthetase है और SpoT द्विआयामी है, एक मजबूत hydrolase और एक कमजोर synthetase के साथ, जिनमें से प्रत्येक एक तनाव निर्भर तरीके से अलग ढंग से विनियमित किया जा सकता है. मजबूत RelA सिंथेटाज सक्रिय है जब codon-निर्दिष्ट आरोप लगाया tRNA की उपलब्धता ribosomal ए साइट के लिए बाध्य जब यह प्रोटीन संश्लेषण की मांग के साथ रखने में विफल रहता है13,14,15. कमजोर SpoT (पी) ppGpp synthetase सक्रिय है, जबकि मजबूत (पी) ppGpp hydrolase अन्य तनाव की स्थिति के जवाब में और अन्य तंत्र के माध्यम से बाधित है. कुछ परिस्थितियों में एसीपी या रु.डी जैसे प्रोटीन स्पोट से बाँध सकते हैं, जो हाइड्रोलिसिस और संश्लेषण16,17के बीच का संतुलन भी बदल सकते हैं. ग्राम पॉजिटिव में, संश्लेषण और हाइड्रोलिसिस मजबूत संश्लेषण और hydrolysis गतिविधियों के साथ एक एकल RelA SpoT homolog (RSH) प्रोटीनके साथ ही छोटे hydrolases और /
(पी) पीपीजीपी न्यूक्लिओटाइड को पहले असामान्य 32पी लेबल स्पॉट के रूप में खोजा गया था जो एमिनो एसिड भुखमरीसे प्रेरित कड़ी प्रतिक्रिया के दौरान पतली परत क्रोमैटोग्राम (टीएलसी) के ऑटोरेडियोग्राम पर दिखाई दिया था। अधिक विस्तृत लेबलिंग प्रोटोकॉल की समीक्षा कीगई है . यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल (चित्र 1) इन प्रोटोकॉलों का एक संशोधन है जो माइक्रोटिटर प्लेटों पर एकाधिक नमूनों के विकास की निगरानी की अनुमति देता है। यह (पी) पीपीजीपी बहुतायत परिवर्तन के कई जैविक और तकनीकी अनुमानों को सुविधाजनक बनाने और शुरू में diauxic बदलाव19के अध्ययन के लिए विकसित किया गया था. की लेबलिंग (पी) ppGpp 32पी और टीएलसी द्वारा पता लगाने के साथ भी की माप की अनुमति देता है (पी) ppGpp गिरावट दर. वैकल्पिक तरीकों को निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है (पी) ppGpp स्तर जैसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री, HPLC20, फ्लोरोसेंट chemosensors21,22, और GFP जीन संलयन ppGpp23से प्रभावित प्रमोटरों के लिए, 24. फ्लोरोसेंट कीमोसेन्सर वर्तमान में बाइंडिंग पीपीजीपीपी के बाद छोटे वर्णक्रमीय बदलावों के साथ-साथ पीपीजीपी और पीपीपीपीपी21के बीच अंतर करने वाली समस्याओं के कारण सीमित उपयोग होता है . इस विधि का पता लगाने के लिए कुशल है (p) ppGpp इन विट्रो में, लेकिन सेलुलर अर्क में नहीं. HPLC शामिल तरीकों में सुधार किया गया है20 लेकिन महंगा उपकरणों की आवश्यकता होती है और अच्छी तरह से उच्च के माध्यम से डाल करने के लिए अनुकूलित नहीं कर रहे हैं. अंत में, GFP संलयन ppGpp निर्भर सक्रियण या निषेध का एक अनुमान दे सकते हैं, लेकिन ppGpp ही उपाय नहीं है. जबकि इन वैकल्पिक तरीकों में से प्रत्येक मूल्यवान हैं, वे महंगा उपकरण या पर्याप्त हाथ समय पर की आवश्यकता होती है, या वे अन्यथा कई गतिज नमूना और बाद में प्रसंस्करण के लिए अनुकूल नहीं हैं. विधि यहाँ वर्णित के साथ, 96 नमूने के बारे में में छह टीएलसी प्लेटों के लिए लागू किया जा सकता 20 मिनट (प्रति प्लेट 18 नमूने), घंटे के एक जोड़े से भी कम समय में टीएलसी विकास द्वारा हल, मात्रात्मक डेटा के साथ कई घंटे या रात भर के बाद प्राप्त की, लेबलिंग के आधार पर तीव्रता.
Protocol
Representative Results
Discussion
कोशिकाओं की समान लेबलिंग के निकट प्राप्त करना इस प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इसलिए, परिभाषित मीडिया, जैसे MOPS या Tris मीडिया का उपयोग, वाहक फॉस्फेट सांद्रता और विशिष्ट गतिविधि की भिन्नता की अनुम…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध Intramural अनुसंधान कार्यक्रम, यूनिस कैनेडी Shriver राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान, NIH का समर्थन किया गया था.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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