大腸菌(p)ppGppの複数の生体内測定に対するマイクロチター皿放射ラベリングの使用、その後に薄層クロマトグラフィー
Summary
マイクロチター皿における放射標識細菌培養物の成長は、(p)ppGppを含むヌクレオチドプールの豊富さの複数の技術的および生物学的複製アッセイを可能にする高スループットサンプリングを促進する。生理的ストレスの原因によって引き起こされる成長遷移の影響だけでなく、ストレスからの回復を監視することができます。.
Abstract
(p)ppGppヌクレオチドは、様々な身体的および栄養的ストレスに応答して細菌のグローバルレギュレータとして機能します。これは、数秒で急速な発症を有し、GTPプールのそれらに近づくか、またはそれを超えるレベルの蓄積につながる。ストレス反転は、(p)ppGppの急速な消失を起こし、多くの場合、1分未満の半減期を伴う。(p)ppGppの存在は、ストレスの有害な影響に対抗する細胞遺伝子発現および代謝の変化をもたらす。グラム陰性およびグラム陽性細菌は異なる応答機構を有するが、両方とも(p)ppGpp濃度に依存する。いずれにせよ、重大なストレス移行期間中に10秒から数時間に変化する可能性のある時間間隔で多くの放射標識細菌培養物を同時に監視する必要があります。このプロトコルは、この技術的な課題に対処します。この方法は、成長(吸光度)の並列モニタリングと均一リン酸放射標識培養物の迅速なサンプリングを可能にする温度およびシェーカー制御マイクロタイター皿インキュベーターを利用して、ヌクレオチドプールを解決し、定量化するPEIセルロース上の薄層クロマトグラフィー。分析の複数の技術的および生物学的複製には、少量のサンプルが必要です。ダイオークティック成長や急速な(p)ppGpp回転率などの複雑な成長遷移は、この方法によって定量的に評価することができる。
Introduction
(p)ppGpp第2のメッセンジャーは、リボソームおよびアミノ酸1、2を合成するための遺伝子を含む多数の遺伝子の発現を調節するグローバルレギュレータである。最初に大腸菌3で発見されたが、(p)ppGppはグラム陽性およびグラム陰性細菌の両方だけでなく、植物の葉緑体4、5で見つけることができる。大腸菌および他のグラム陰性細菌の場合、(p)ppGppは2つの異なる部位6、7、8でRNAポリメラーゼと直接相互作用する。グラム陽性では、(p)ppGppは、CodYによって感知されるGTPの存在量を阻害し、調節9、10につながる遺伝子特異的DNA認識モチーフを有するGTP結合タンパク質である。(p)ppGppは、異なる栄養素およびストレス条件に対する飢餓に応答して蓄積し、ストレス11、12への適応を可能にする遺伝子発現の成長および調整が遅くなる。
ppGpp累積の正味量は、合成酵素とヒドロラーゼ活性のバランスを反映しています。大腸菌RelAは強い合成酵素であり、SpoTは、強いヒドロラーゼと弱い合成酵素を有する二機能性であり、それぞれがストレス依存的な方法で異なる調節される可能性がある。強力なRelA合成酵素は、タンパク質合成13、14、15の要求に追いつかない場合にリボソームA部位に結合したコドン指定荷電tRNAの利用可能性が活性化される。弱いSpoT(p)ppGpp合成酵素は、強い(p)ppGppヒドロラーゼが他のストレス条件に応答し、他のメカニズムを介して阻害される間活性化される。いくつかの条件下では、ACPまたはRsdのようなタンパク質はSpoTに結合することができ、これは加水分解と合成16、17の間のバランスも変化する。グラム陽性では、合成および加水分解は、強力な合成および加水分解活性を持つ単一のRelA SpoTホモログ(RSH)タンパク質と、より小さなヒドロラーゼおよび/または合成酵素12との間のより複雑なバランスを反映する。
(p)ppGppヌクレオチドは、アミノ酸飢餓3によって誘導される厳しい応答の間に薄層クロマトグラム(TLC)の自動ラジオグラムに現れた珍しい32 P標識スポットとして最初に発見された。 より詳細なラベリングプロトコルが18を見直されました。 ここで説明するプロトコル(図1)は、マイクロティタープレート上の複数のサンプルの増殖を監視することを可能にするこれらのプロトコルの変更である。これは、(p)ppGppの豊富な変化の複数の生物学的および技術的な推定を容易にし、当初はダイオシックシフト19の研究のために開発された。32Pによる(p)ppGppのラベリングとTLCによる検出により、(p)ppGpp分解速度の測定も可能です。質量分析、HPLC20、蛍光ケモセンサ21、22、およびppGpp23の影響を受けるプロモーターへのGFP遺伝子融合などの(p)ppGppレベルを決定するための代替方法が開発され、24.蛍光ケモセンサは、現在、ppGppを結合した後の小さなスペクトルシフトによる限られた使用だけでなく、ppGppとpppGpp21を区別する問題を有する。この方法は、(p)ppGppをインビトロで検出するのに効率的であるが、細胞抽出物では検出しない。HPLCを含む方法は20に改善されましたが、高価な機器を必要とし、高スループットに十分に適応していません。最後に、GFP融合はppGpp依存活性化または阻害の推定値を与えることができるが、ppGpp自体を測定しない。これらの代替方法はそれぞれ価値がありますが、高価な機器や実質的なハンズオン時間が必要な場合や、複数の運動サンプリングやその後の処理に対応できません。ここで説明する方法では、96個のサンプルを約20分(プレート当たり18サンプル)で6枚のTLCプレートに適用することができ、TLC開発により数時間未満で解決され、ラベリングに応じて数時間または一晩後に得られた定量データを用いて強度。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞のほぼ均一な標識を達成することは、このプロトコルの重要なステップです。したがって、MOPSまたはTrisメディアなどの定義された媒体の使用は、キャリアリン酸濃度および特定の活性の変動を可能にするために重要である。M9 やメディア A などのリン酸緩衝メディアは使用できません。ほとんどの未定義の培地には、LB、トリプトン、カサミノ酸などの可変量のリン酸塩が含まれていま…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ユーニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健人間開発研究所(NIH)の内壁研究プログラムを支援しました。
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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