Bruke mikrotiterbrønnene Dish Radiolabeling for flere in vivo målinger av Escherichia coli (p) ppGpp etterfulgt av tynne lag kromatografi
Summary
Veksten av radiolabeled bakteriell kulturen inne mikrotiterbrønnene fat Letter høy produksjon prøving det innrømmer mangfoldig teknisk og Biological duplisere analyser av nukleotid basseng overflod, inkluderer det av (pencen) ppGpp. Effektene av vekst overganger provosert av kilder til fysiologisk stress, samt utvinning fra stress kan overvåkes.
Abstract
The (p) ppGpp nukleotid fungerer som en global regulator i bakterier som svar på en rekke fysiske og ernæringsmessige stress. Den har en rask debut, i sekunder, noe som fører til opphopning av nivåer som nærmer eller overskrider de av GTP bassenger. Stress reversering anledninger en rask forsvinningen av (p) ppGpp, ofte med en halveringstid på mindre enn et minutt. Tilstedeværelsen av (p) ppGpp resulterer i endringer av cellulære genuttrykk og metabolisme som motvirke de skadelige virkningene av stress. Gram-negative og gram-positive bakterier har forskjellige reaksjons mekanismer, men begge avhenger av (p) ppGpp konsentrasjon. I alle tilfelle, det er en nød å samtidig dataskjerm mange radiolabeled bakteriell kulturen for tid intervaller det kanskje variere fra 10 sekunder å timene i løpet av betenkelig trykk overgang perioder. Denne protokollen løser denne tekniske utfordringen. Metoden utnytter temperatur-og shaker-kontrollerte mikrotiterbrønnene parabolen inkubatorer som tillater parallell overvåking av vekst (absorbansen) og rask prøvetaking av jevnt fosfat-radiolabeled kulturer å løse og quantitate nukleotid bassenger ved tynt lag kromatografi på PEI-cellulose. Små mengder utvalg er nødvendig for flere tekniske og biologiske replikerer av analyser. Komplekse vekst overganger, slik som diauxic vekst og rask (p) ppGpp omløpshastighet kan kvantitativt vurderes av denne metoden.
Introduction
The (p) ppGpp andre Messenger er en global regulator som modulerer uttrykk for et stort antall gener, inkludert gener for syntetisere ribosomer og aminosyrer1,2. Selv om utgangspunktet oppdaget i Escherichia coli3, (p) ppGpp kan finnes i både gram positive og gram negative bakterier så vel som i anlegget Chloroplasts4,5. For E. coli og andre gram-negative bakterier, (p) ppGpp samhandler direkte med RNA polymerase på to forskjellige steder6,7,8. I gram positiver, (p) ppGpp hemmer GTP overflod, som er følt av CodY, en GTP-bindende protein med Gen-spesifikke DNA-anerkjennelse motiver som fører til regulering9,10. (p) ppGpp akkumuleres som svar på sult for ulike næringsstoffer og stress forhold, noe som resulterer i langsom vekst og justeringer av genet uttrykk for å tillate tilpasning til stress11,12.
Nettobeløpet for ppGpp akkumulert reflekterer en balanse mellom syntetase og Hydrolase aktiviteter. I E. coli forholdet er en sterk Syntetase og SpoT er bifunctional, med en sterk Hydrolase og en svak syntetase, som hver kan være regulert forskjellig i en stress avhengig måte. Den sterke forholdet syntetase aktiveres når tilgjengeligheten av Codon-spesifiserte ladet tRNA bundet til ribosomal et område når den ikke klarer å holde tritt med kravene til proteinsyntese13,14,15. Det svake punktet (p) ppGpp-syntetase aktiveres mens den sterke (p) ppGpp-Hydrolase blir hemmet som følge av andre stress forhold og gjennom andre mekanismer. Under noen forhold kan proteiner som ACP eller RSD bindes til SpoT, som også endrer balansen mellom hydrolyse og syntese16,17. I gram positiver reflekterer syntese og hydrolyse en mer kompleks balanse mellom et enkelt forholdet SpoT homologe (RSH) protein med sterk syntese og hydrolyse aktiviteter så vel som mindre hydrolases og/eller synthetases12.
The (p) ppGpp nukleotider ble først oppdaget som uvanlige 32p merket flekker som dukket opp på autoradiograms av tynne-lags KROMATOGRAMMENE (TLC) under en streng respons indusert av aminosyre sult3. Mer detaljerte merking protokoller har gjennomgått 18. Protokollen som beskrives her (figur 1) er en modifikasjon av disse protokollene som gjør det mulig å overvåke vekst av flere prøver på mikrotiterbrønnene plater. Dette forenkler flere biologiske og tekniske anslag over (p) ppGpp overflod endringer og ble opprinnelig utviklet for studier av diauxic Skift19. Merking av (p) ppGpp med 32p og deteksjon av TLC tillater også målinger av (p) ppGpp ned brytnings rater. Alternative metoder er utviklet for å bestemme (p) ppGpp nivåer som masse massespektrometri, HPLC20, fluorescerende chemosensors21,22, og GFP gen fusjoner til arrangører berørt av ppGpp23, 24. fluorescerende chemosensors for tiden har en begrenset bruk på grunn av små Spectral Skift etter binding ppGpp samt problemer skille mellom PpGpp og pppGpp21. Denne metoden er effektiv for å oppdage (p) ppGpp in vitro, men ikke i cellulære ekstrakter. Metoder som involverer HPLC har blitt forbedret20 , men krever dyrt utstyr og er ikke godt tilpasset til høy gjennom-PUT. Til slutt kan GFP fusjoner gi et anslag på ppGpp avhengig aktivering eller hemming, men ikke måle ppGpp selv. Mens hver av disse alternative metoder er verdifulle, de krever dyrt utstyr eller betydelig hands-on tid, eller de er ellers ikke mottagelig for flere kinetisk prøvetaking og påfølgende prosessering. Med metoden beskrevet her, 96 prøver kan brukes på seks TLC plater i ca 20 min (18 prøver per plate), løst av TLC utvikling på mindre enn et par timer, med kvantitative data innhentet etter flere timer eller over natten, avhengig av merking Intensitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Å oppnå nær uniform merking av cellene er et kritisk trinn for denne protokollen. Derfor er bruken av definerte medier, for eksempel MOPPER eller Tris Media, avgjørende for å muliggjøre variasjon av fosfat konsentrasjoner av bærebølge og spesifikk aktivitet. Fosfat-bufrede medier, for eksempel M9 eller Media A, kan ikke brukes. De fleste udefinert medier inneholder variable mengder fosfat, slik som LB, tryptone og casamino syrer. Den fosfat isotop 33p er en svakere emitter som kan erstatte 32</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet intramural Research program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child helse og Human Development, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
Riferimenti
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
