Использование Microtiter Блюдо Радиомаркировка для нескольких В Ививо Измерения Escherichia coli (p)ppGpp Следуют Тонкий слой хроматографии
Summary
Рост радиомаркированных бактериальных культур в посудах микротитеров облегчает выборку с высокой пропускной мощностью, что позволяет многократно ерастить анализы изобилия нуклеотидов бассейнов, в том числе (p)ppGpp. Последствия переходов роста, вызванных источниками физиологического стресса, а также восстановление мгновения после стресса, могут контролироваться.
Abstract
Нуклеотид (p)ppGpp функционирует как глобальный регулятор бактерий в ответ на различные физические и питательные стрессы. Он имеет быстрое начало, в секундах, что приводит к накоплению уровней, которые приближаются или превышают уровни пулов GTP. Стресс разворота случаях быстрого исчезновения (p)ppGpp, часто с периодом полураспада менее минуты. Наличие (p)ppGpp приводит к изменению экспрессии клеточных генов и метаболизма, которые противостоят разрушительным последствиям стресса. Грамотрицательные и грамположительные бактерии имеют различные механизмы реакции, но оба зависят от (p)ppGpp концентрации. В любом случае, существует необходимость одновременного мониторинга многих радиомаркированных бактериальных культур с интервалом во времени, которые могут варьироваться от 10 секунд до часов во время критических периодов перехода стресса. Этот протокол решает эту техническую проблему. Метод использует температуры и шейкер контролируемых микротитер овраник иинкубаторы, которые позволяют параллельный мониторинг роста (абсорбции) и быстрый отбор проб равномерно фосфат-радиоlabeled культур для решения и количественно нуклеотидных бассейнов хроматография на PEI-целлюлозе. Небольшие объемы выборки необходимы для нескольких технических и биологических повторов анализов. С помощью этого метода можно количественно оценить сложные переходы роста, такие как диотический рост и быстрые (p)ppGpp коэффициенты текучести кадров.
Introduction
Второй посланник (p)ppGpp является глобальным регулятором, который модулирует экспрессию большого количества генов, включая гены для синтеза рибосом и аминокислот1,2. Хотя первоначально обнаружены в Escherichia coli3, (p)ppGpp можно найти в обоих Грам положительных и грам отрицательных бактерий, а также в растительных хлоропластов4,5. Для кишечной палочки и других грамотрицательных бактерий, (p)ppGpp взаимодействует непосредственнос РНК-полимераза на двух различных участках 6,7,8. В Gram срабатывает, (p)ppGpp ингибирует изобилие GTP, которое чувствуется CodY, GTP-связывающимпротеином с ген-специфическими мотивами распознавания ДНК которые водят к регулировке 9,10. (p)ppGpp накапливается в ответ на голод для различных питательных веществ и стрессовых условий, что приводит к медленному росту и корректировке экспрессии генов, чтобы адаптация к стрессу11,12.
Чистый объем накопленного ppGpp отражает баланс между синтезаза и гидролаза деятельности. В E. coli RelA является сильным синтезатором и SpoT является бифункциональным, с сильной гидролазы и слабой синтеза, каждый из которых может регулироваться по-разному в зависимости от стресса образом. Сильный синтезатор RelA активируется, когда наличие кодона-указанного заряженного tRNA связано с рибосомальным местом, когда он не в состоянии идти в ногу с требованиями синтеза белка13,14,15. Слабый SpoT (p)ppGpp синтезатаза активируется в то время как сильный (p)ppGpp гидролаза ингибируется в ответ на другие стрессовые условия и через другие механизмы. При некоторых условиях, белки, такие как ACP или Rsd может связываться с SpoT, которые также изменить баланс между гидролизом и синтезом16,17. В Gram срабатываний, синтез и гидролиз отражают более сложный баланс между одним relA SpoT омолог (RSH) белка с сильным синтезом и гидролизом деятельности, а также меньшие гидролазы и / или синтезаторы12.
(p)ppGpp нуклеотиды были впервые обнаружены как необычные 32 Pпомечены пятна, которые появились на авторадиограммы тонкослойных хроматограмм (TLC) во время строгой реакции индуцированной аминокислоты голодания3. Более подробные протоколы маркировки были рассмотрены 18. Описанный здесь протокол(рисунок1) является модификацией этих протоколов, которая позволяет контролировать рост нескольких образцов на микротитерных пластинах. Это облегчает несколько биологических и технических оценок (p)ppGpp изменения изобилия и был первоначально разработан для исследований диоксических сдвигов19. Маркировка (p)ppGpp с 32P и обнаружение TLC также позволяет измерения (p)ppGpp скорости деградации. Альтернативные методы были разработаны для определения (p)ppGpp уровней, таких как масс-спектрометрия, HPLC20, флуоресцентные химиосенсоры21,22, и GFP синтезгенов для промоутеров, пострадавших от ppGpp23, 24. Флуоресцентные химиосенсоры в настоящее время имеют ограниченное использование из-за небольших спектральных сдвигов после связывания ppGpp, а также проблемы, проводящие различие между ppGpp и pppGpp21. Этот метод эффективен для обнаружения (p)ppGpp in vitro, но не в клеточных экстрактах. Методы с участием HPLC были улучшены20, но требуют дорогостоящего оборудования и не хорошо адаптированы к высокой через-положить. Наконец, слияние GFP может дать оценку активации или торможения ppGpp, но не измерить ppGpp себя. Хотя каждый из этих альтернативных методов ценен, они требуют дорогостоящего оборудования или значительного практического времени, или в противном случае они не поддаются нескольким кинетической выборки и последующей обработки. С помощью описанного здесь метода 96 образцов могут быть применены к шести пластинам TLC примерно за 20 минут (18 образцов на тарелку), решенными за счет разработки TLC менее чем за пару часов, при этом количественные данные, полученные через несколько часов или за одну ночь, в зависимости от маркировки Интенсивность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Достижение почти единообразной маркировки ячеек является критическим шагом для этого протокола. Таким образом, использование определенных носителей, таких как MOPS или Tris media, имеет решающее значение для обеспечения изменения концентрации переносчиков фосфатов и конкретной активности…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы, Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
Riferimenti
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
