살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수
Summary
세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.
Abstract
경쟁 지수는 세균적 적합성 및/또는 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 접근법의 유용성은 수행하기 쉽고 야생 형 유기체에 많은 균주의 적합성을 표준화하는 능력에 의해 예시됩니다. 이 기술은 그러나, 유효한 자형표 마커 및 동시에 평가될 수 있는 긴장의 수에 의해, 복제 실험의 큰 숫자에 대한 필요를 만드는 제한됩니다. 많은 수의 실험과 동시에, 자형표 마커에 기초한 박테리아를 정량화하기 위한 인건비 및 재료 비용은 중요하지 않다. 긍정적인 양상을 유지하면서 이러한 부정적인 측면을 극복하기 위해, 우리는 세균 염색체에 유전 마커를 엔지니어링 한 후 미생물을 직접 정량화하는 분자 기반 접근법을 개발했습니다. 독특한, 25 염기 쌍 DNA 바코드는 살모넬라의야생 형 및 돌연변이 균주의 염색체에 무해한 궤적에 삽입되었다. 시험관내 경쟁 실험은 풀링된 균주로 구성된 이노큘라를 사용하여 수행하였다. 경쟁 후, 각 스트레인의 절대 숫자는 디지털 PCR을 사용하여 정량화하고 각 변형에 대한 경쟁 지수는 그 값에서 계산되었다. 우리의 데이터는 살모넬라정량화에 대한 이 접근법이 매우 풍부하고 정확하며, 매우 풍부하고(높은 체력) 및 희귀(낮은 피트니스) 미생물을 모두 검출하는 데 매우 민감하고 정확하며 정확하다는 것을 나타냅니다. 또한,이 기술은 미생물의 절대 정량화를 필요로하는 다양한 실험 설계뿐만 아니라 수정 할 수있는 염색체를 가진 거의 모든 유기체에 쉽게 적응 할 수 있습니다.
Introduction
병원성 유기체의 적합성 과 독성을 평가하는 것은 미생물학 연구의 근본적인 양상입니다. 그것은 균주 사이 또는 돌연변이된 유기체 사이 비교를 가능하게 합니다, 이는 연구원이 특정 조건의 밑에 특정 유전자의 중요성을 결정하는 것을 허용합니다. 전통적으로, 독성 평가는 다른 세균성 긴장을 사용하여 감염된 동물의 결과를 관찰하는 감염의 동물 모형을 이용합니다 (예를 들면 감염성 복용량50,치명적인 복용량50,죽음에 시간, 현상 엄격, 부족의 증상 등) 이 절차는 독성에 대한 귀중한 설명을 제공하지만 야생 형의 변화를 감지하기 위해 결과에 상당한 차이를 일으키기 위해 균주가 필요합니다. 더욱이, 결과는 질병 진행및 현상 엄격이 시간이 지남에 따라 주관적으로 정량화될 수 있기 때문에, 야생 형에 비교된 독성의 해석은 더 질적입니다 (즉, 더, 더 적게, 또는 동등하게 악성). 동물 감염 성 검사를 수행하는 일반적인 대안은 경쟁 지수 (CIs)를 생성하는 것입니다, 직접 혼합 감염에서 야생 형 대응에균주의 적합성 또는 독성을 비교값 1. 이 기술은 야생 형 균주에 독성을 표준화하고 감쇠정도를 반영하는 정량적 값을 결정함으로써 감염의 전통적인 동물 모델에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 취소된 경쟁 지수(COI) 2를 결정함으로써 박테리아에서의유전자 상호작용을 분석하기 위해 적응될 수 있다. 돌연변이 된 유기체의 그룹에 대한 COI를 계산하면 연구원은 두 유전자가 독립적으로 발병 기전에 기여하는지 또는 동일한 독성 경로에 관여하고 서로 의존하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 추가적으로, CI를 계산하는 것은 유기체의 병인에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 박테리아의 열거를 요구합니다. C와 COIs는 또한 연구원이 임상 질병을 일으키지 않지만 여전히 체력에 차이가있는 avirulent 균주를 어지러이로 할 수 있습니다. 이 기술은 긴장을 확인하기 위하여 전통적인 항생 저항 마커의 사용에 의해 제한되고, 따라서 입력 긴장의 수를 한 번에 하나 또는 두개로 제한합니다. 이러한 제한으로 인해 많은 수의 실험 그룹과 복제가 필요하며, 이는 인건비와 재료 비용을 추가하는 것 외에도 실험 조건의 가변성과 부정확한 결과의 변동성을 증가시킵니다. (독성, 피트니스 및 유전자 상호 작용을 연구하기 위해 혼합 감염을 사용하는 이점과 응용 프로그램에 대한 철저한 검토는 C.R. Beuzón 및 D.W. Holden 1참조)
이러한 한계를 극복하기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 형광 표지세포의 사용이 유세포분석3,4,5를통해 정량화되었다. 이 기술은 1) 표지된 항체를 사용하여 세포에 자형표 또는 2) 내인성 형광 단백질을 생성하여 정량화합니다. 표지된 항체의 사용은 1,000 개의 세포 / mL의 검출한계를 가지고 있으며,따라서 3을 분석하기 위해 많은 수의 세포가 필요합니다. 형광 성 단백질을 발현하는 세포는 변형된 생리학을 가지며 고단백 발현으로 인한 체력 변화에 취약하다6. 두 방법 모두 유세포측정법을 사용하여 검출가능한 형광 마커의 수에 의해 제한된다. 분자 정량화의 발전은 뮤린 모델7에서1,000 개 이상의 균주의 초기 혼합 감염에서 120 개의 균주에서 감쇠를 감지하는 마이크로 어레이 기술의 개발을 통해 달성되었습니다. 이 기술은 결과에 있는 상당한 가변성으로 이끌어 내는 돌연변이된 긴장에서 RNA의 마이크로어레이 분석을 이용했습니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 혼합 된 감염의 큰 풀이 유용한 도구가 될 수 있으며 민감한 검출 기술을 활용하여 세균 독성의 차이를 식별 할 수 있음을 확립했습니다. 차세대 염기서열 분석의 발달로 Tn-seq는 트랜스포종 돌연변이의 유용성을 확장하여 무작위로 돌연변이된 박테리아를 정량화하는강력한 방법을 8,9,10, 11. 트랜스포손의 필요성을 제거하고 대신 DNA 바코드를 사용하여 게놈 변화와 피트니스에 미치는 영향을 보다 쉽게 식별하고 추적하는 대체 프로토콜이 최근에 개발되었습니다12. 이 기술은 중요한 발전이지만 게놈 바코드의 삽입은 여전히 임의의 과정입니다. 이전 실험의 무작위성을 극복하기 위해, Yoon et al.은 박테리아13의염색체 상에서 정확한 위치에 삽입된 독특한 DNA 바코드를 사용하여 살모넬라 균주의 CI를 계산하는 방법을 개발하였다. 고유한 바코드 균주는 각 고유 바코드에 특적인 SYBR 녹색 및 프라이머를 사용한 qPCR 기반 방법을 사용하여 검출되었습니다. 이 기술은 프라이머 효율성의 차이와 낮은 감도를 포함하여 qPCR에 의해 부과된 제약 조건에 의해 제한되었으며, qPCR 이전에 중첩-PCR의 필요성이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근은 표적으로 한 게놈 수정이 다중 세균성 긴장의 풀을 검출하고 잠재적으로 정량화하기 위해 이용될 수 있었다는 것을 보여주었습니다.
다음 프로토콜에서, 우리는 매우 민감한 디지털 PCR 기술을 사용하여 정확한 정량화 뒤에 혼합 inocula의 큰 풀과 세균 경쟁 실험을 수행하는 새로운 방법론을 설명합니다. 프로토콜은 염색체의 무해한 지구에 삽입된 유일한 DNA 바코드를 가진 유전으로 표지하는 세균성 긴장을 관련시킵니다. 이 수정을 통해 기존 직렬 희석, 복제 도금 및 표현형 마커(즉, 항생제 내성)에 의존하는 식민지 형성 단위 를 계산하는 대신 현대 분자 기술을 사용하여 균주를 빠르고 정확하게 정량화할 수 있습니다. ). 수정은 모든 균주가 정확한 동일한 조건에 노출되기 때문에 단일 풀화 접종에서 많은 균주의 동시 평가를 허용, 실질적으로 실험 가변성의 가능성을 감소. 또한, 이 기술은 살모넬라 장테리카 혈청염에서 개발되었지만, 모든 유전적으로 가단성 유기체및 정확한 세균 수가 필요한 거의 모든 실험 설계에 매우 적응력이 있어 새로운 이전 방법에 의해 부과 된 제약없이 미생물학 실험실의 정확성과 처리량을 높이기 위한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미생물을 정확하게 정량화하는 능력은 미생물학 연구에 가장 중요하며, 초기 혼합 인구에서 독특한 균주를 열거하는 능력은 적합성 및 독성 특성을 평가하기위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다. 박테리아. 그러나, 이것을 달성하기 위한 기술은 분자 생물학에 있는 현대 발달과 보조를 맞추지 않았습니다. 이 기술은 S를 포함한 많은 박테리아의 염색체를 용이하게 수정할 수 있다. Typhimuri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에 보고 된 연구는 조지 F. Haddix 대통령의 교수 연구 기금과 국립 보건원의 일반 의학 연구소에 의해 지원 되었다 (NIH) 수상 번호 GM103427. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
Riferimenti
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