Изучение пространства последовательности для определения связывающих сайтов для регулятивных РНК-связывающих белков
Summary
Специфика последовательности имеет решающее значение для регуляции генов. Регуляторные белки, распознающие определенные последовательности, важны для регуляции генов. Определение функциональных связывающих участков для таких белков является сложной биологической проблемой. Итеративный подход к идентификации связывающего участка для РНК-связывающего белка описан здесь и применим ко всем БЕЛКАм-связывающим РНК.
Abstract
Регуляция генов играет важную роль во всех клетках. Транскрипционные, посттранскрипционные (или РНК обработки), переводные и пост-трансляционные шаги используются для регулирования конкретных генов. Последовательность конкретных нуклеиновых кислот-связывающих белков целевой конкретных последовательностей для контроля пространственной или временной экспрессии генов. Места связывания нуклеиновых кислот, как правило, характеризуются мутационным анализом. Тем не менее, многочисленные белки, представляющие интерес не имеют известного места связывания для такой характеристики. Здесь мы описываем подход к выявлению ранее неизвестных мест связывания РНК-связывающих белков. Она включает в себя итеративный отбор и усиление последовательностей, начиная с рандомизированного пула последовательности. После нескольких раундов этих шагов-транскрипции, связывания и усиления-обогащенных последовательностей секвенируются для определения предпочтительного места связывания (ы). Успех этого подхода контролируется с помощью анализов привязки in vitro. Впоследствии, in vitro и in vivo функциональные анализы могут быть использованы для оценки биологической значимости выбранных последовательностей. Этот подход позволяет идентифицировать и характеристики ранее неизвестного места связывания (ы) для любого РНК-связывающего белка, для которого существует анализ на отделение белковых и несвязанных РНК.
Introduction
В клеточной биологии центральную роль играет регуляция генов. На одном или нескольких шагах вдоль пути экспрессии генов гены могут регулироваться. Эти шаги включают транскрипцию (инициация, удлинение и прекращение), а также сплайсинг, полиаденилацию или 3′ конечную формацию, экспорт РНК, перевод мРНК и распад/локализацию первичных транскриптов. На этих этапах нуклеиновые кислотно-связывающие белки модулируют регуляцию генов. Определение связывающих участков для таких белков является важным аспектом изучения генного контроля. Мутационный анализ и сравнение филогенетической последовательности были использованы для обнаружения регулятивных последовательностей или белково-связывающих сайтов в нуклеиновых кислот, таких как промоутеры, сращивания сайтов, полиаденелизационных элементов, и трансляционные сигналы1, 2 , 3 , 4.
Предварительное сращивание является неотъемлемым шагом при экспрессии и регуляции генов. Большинство генов млекопитающих, в том числе у людей, имеют интроны. Большая часть этих транскриптов альтернативно сращиваются, производя несколько мРНК и белковых изоформ из одного и того же гена или первичного транскрипта. Эти изоформы имеют клеточную и развитую роль в клеточной биологии. 5′ сращивания сайта, ветвь-точка, и полипиримидин тракта / 3 ‘ сращивания сайт критических сигналов сращивания, которые подлежат регулированию. В отрицательном регулировании, в противном случае сильное место сращивания репрессировано, тогда как в положительном регулировании в противном случае слабое место сращивания активировано. Сочетание этих событий производит множество функционально различных изоформ. РНК-связывающие белки играют ключевую роль в этих альтернативных событиях сращивания.
Многочисленные белки известны, чьи цели связывания (ы)или РНК-мишени остаются идентифицированными 5,6. Связывание регулятивных белков с их биологическими целями или последовательностями вниз по течению часто является сложным процессом. Для таких белков определение их целевой РНК или места связывания является важным шагом в определении их биологических функций. Как только место связывания идентифицировано, его можно дополнительно охарактеризовать с помощью стандартных молекулярных и биохимических анализов.
Описанный здесь подход имеет два преимущества. Во-первых, он может определить ранее неизвестный сайт связывания для белка, представляющих интерес. Во-вторых, дополнительным преимуществом этого подхода является то, что он одновременно позволяет мутагенеза насыщения, который в противном случае был бы трудоемким для получения сопоставимой информации о требованиях последовательности в пределах связывающего сайта. Таким образом, он предлагает более быстрый, простой и менее дорогостоящий инструмент для определения мест связывания белка в РНК. Первоначально этот подход (SELEX или систематическая эволюция лигандов eXponential обогащения) был использован для характеристики связывающего места для бактериофага T4 ДНК полимераза (ген 43 белка), который перекрывается с рибосомой связывания сайта в своей собственной мРНК. Обязательный сайт содержит 8-базовую последовательность цикла, представляющую 65 536 рандомизированных вариантов для анализа7. Во-вторых, этот подход также независимо использовался для того, чтобы показать, что из пула примерно 1013 последовательностейможновыбрать определенные места связывания или аптамеров для различных красителей. В самом деле, этот подход был широко используется во многих различных контекстах для выявления aptamers (РНК или последовательности ДНК) для связывания многочисленных лигандов, таких как белки, маленькие молекулы и клетки, и для катализа9. Например, аптамер может различать два производных ксантина, кофеин и теофиллин, которые отличаются наличием одной метиловой группы в кофеине10. Мы широко использовали этот подход (SELEX или итеративный отбор-усиление) для изучения того, как РНК-связывающие белки функционируют в сращивании или сращивании регулирования11, который будет основой для обсуждения ниже.
Случайная библиотека: Мы использовали случайную библиотеку из 31 нуклеотидов. Рассмотрение длины случайной библиотеки было слабо основано на идее, что общий коэффициент сращивания U2AF65 связывается с последовательностью между последовательностью ветвя- точек и 3′ сращивания сайта. В среднем расстояние между этими сплайсинг-сигналами у метазоанов составляет от 20 до 40 нуклеотидов. Другой белок Секс-смертельный, как известно, связываются с плохо характеризуется нормативной последовательности вблизи 3′ сращивания сайте своей цели до мРНК, трансформатор. Таким образом, мы выбрали случайную область из 31 нуклеотидов, в окружении грунтовых связывающих участков с местами ограничения фермента, чтобы обеспечить усиление ПЦР и крепление промоторизатора T7 РНК-полимераза для транскрипции in vitro. Теоретический размер или сложность библиотеки составили 431 или приблизительно 1018. Мы использовали небольшую часть этой библиотеки, чтобы подготовить наш случайный пул РНК (1012-1015) для экспериментов, описанных ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нуклеиновые кислотно-связывающие белки являются важными регуляторами развития животных и растений. Ключевым требованием для процедуры SELEX является разработка анализа, который может быть использован для разделения белковых и несвязанных рнковых фракций. В принципе, это анализ может б…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор благодарит Национальные институты здравоохранения за прошедшее финансирование.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).
