Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine
Summary
Sequenzspezifität ist entscheidend für die Genregulation. Regulatorische Proteine, die bestimmte Sequenzen erkennen, sind wichtig für die Genregulation. Die Definition funktioneller Bindungsstellen für solche Proteine ist ein schwieriges biologisches Problem. Ein iterativer Ansatz zur Identifizierung einer Bindungsstelle für ein RNA-bindendes Protein wird hier beschrieben und ist auf alle RNA-bindenden Proteine anwendbar.
Abstract
Die Genregulation spielt in allen Zellen eine wichtige Rolle. Transkriptionale, posttranskriptionelle (oder RNA-Verarbeitung), translationale und posttranslationale Schritte werden verwendet, um bestimmte Gene zu regulieren. Sequenzspezifische Nukleinsäure-bindende Proteine zielen auf spezifische Sequenzen ab, um die räumliche oder zeitliche Genexpression zu steuern. Die Bindungsstellen in Nukleinsäuren sind typischerweise durch Mutationsanalyse gekennzeichnet. Zahlreiche Proteine von Interesse haben jedoch keine bekannte Bindungsstelle für eine solche Charakterisierung. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Identifizierung bisher unbekannter Bindungsstellen für RNA-bindende Proteine. Es beinhaltet iterative Auswahl und Verstärkung von Sequenzen beginnend mit einem randomisierten Sequenzpool. Nach mehreren Runden dieser Schritte-Transkription, Bindung und Verstärkung werden die angereicherten Sequenzen sequenziert, um eine bevorzugte Bindungsstelle(n) zu identifizieren. Der Erfolg dieses Ansatzes wird mit In-vitro-Bindungstests überwacht. Anschließend können in vitro und in vivo funktionelle Assays verwendet werden, um die biologische Relevanz der ausgewählten Sequenzen zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung einer bisher unbekannten Bindungsstelle(n) für jedes RNA-bindende Protein, für das ein Assay zur Trennung proteingebundener und ungebundener RNAs existiert.
Introduction
In der Zellbiologie spielt die Genregulation eine zentrale Rolle. In einem oder mehreren Schritten entlang des Genexpressionswegs haben Gene das Potenzial, reguliert zu werden. Diese Schritte umfassen Transkription (Initiierung, Dehnung und Beendigung) sowie Spleißen, Polyadenylierung oder 3′ Endbildung, RNA-Export, mRNA-Translation und Zerfall/Lokalisierung von primären Transkripten. In diesen Schritten modulieren Nukleinsäure-bindende Proteine die Genregulation. Die Identifizierung von Bindungsstellen für solche Proteine ist ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der Genkontrolle. Mutationsanalyse und phylogenetischer Sequenzvergleich wurden verwendet, um regulatorische Sequenzen oder Proteinbindungsstellen in Nukleinsäuren wie Promotoren, Spleißstellen, Polyadenylierungselementen und Translationssignalen zu entdecken1, 2 , 3 , 4.
Pre-mRNA Spleißen ist ein integraler Schritt während der Genexpression und -regulation. Die Mehrheit der Säugetiergene, auch die beim Menschen, haben Introns. Ein großer Teil dieser Transkripte wird alternativ gespleißt, wodurch mehrere mRNA- und Protein-Isoformen aus demselben Gen oder Primärtranskript erzeugt werden. Diese Isoformen haben zellspezifische und entwicklungsspezifische Rollen in der Zellbiologie. Die 5′ Spleißstelle, der Astpunkt und der Polypyrimidin-Trakt/3′ Spleißstelle sind kritische Spleißsignale, die einer Regulierung unterliegen. Bei negativer Regulierung wird eine ansonsten starke Spleißstelle verdrängt, während bei positiver Regulierung eine ansonsten schwache Spleißstelle aktiviert wird. Eine Kombination dieser Ereignisse erzeugt eine Fülle von funktionell unterschiedlichen Isoformen. RNA-bindende Proteine spielen bei diesen alternativen Spleißereignissen eine Schlüsselrolle.
Es sind zahlreiche Proteine bekannt, deren Bindungsstellen oder RNA-Targets noch identifiziert werden müssen5,6. Die Verknüpfung von regulatorischen Proteinen mit ihren nachgelagerten biologischen Zielen oder Sequenzen ist oft ein komplexer Prozess. Für solche Proteine ist die Identifizierung ihrer Ziel-RNA oder Bindungsstelle ein wichtiger Schritt bei der Definition ihrer biologischen Funktionen. Sobald eine Bindungsstelle identifiziert ist, kann sie durch molekulare und biochemische Standardanalysen weiter charakterisiert werden.
Der hier beschriebene Ansatz hat zwei Vorteile. Erstens kann es eine bisher unbekannte Bindungsstelle für ein Protein von Interesse identifizieren. Zweitens besteht ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes darin, dass er gleichzeitig eine Sättigungsmutagenese ermöglicht, die ansonsten arbeitsintensiv wäre, um vergleichbare Informationen über Sequenzanforderungen innerhalb der Bindungsstelle zu erhalten. Somit bietet es ein schnelleres, einfacheres und kostengünstigeres Werkzeug, um Proteinbindungsstellen in der RNA zu identifizieren. Ursprünglich wurde dieser Ansatz (SELEX oder Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) verwendet, um die Bindungsstelle für die Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase (Gen 43-Protein) zu charakterisieren, die sich mit der Ribosom-Bindungsstelle in ihrer eigenen mRNA überlappt. Die Bindungsstelle enthält eine 8-Basis-Loop-Sequenz, die 65.536 randomisierte Varianten für die Analyse7darstellt. Zweitens wurde der Ansatz auch unabhängig verwendet, um zu zeigen, dass spezifische Bindungsstellen oder Aptamer für verschiedene Farbstoffe aus einem Pool von etwa 1013 Sequenzen8ausgewählt werden können. Tatsächlich wurde dieser Ansatz in vielen verschiedenen Kontexten verwendet, um Aptamer (RNA- oder DNA-Sequenzen) für die Bindung zahlreicher Liganden, wie Proteine, kleine Moleküle und Zellen, und für die Katalyse9zu identifizieren. Ein Aptamer kann beispielsweise zwischen zwei Xanthin-Derivaten, Koffein und Theophyllin, unterscheiden, die sich durch das Vorhandensein einer Methylgruppe in Koffein10unterscheiden. Wir haben diesen Ansatz (SELEX oder iterative Selektionsverstärkung) ausgiebig genutzt, um zu untersuchen, wie RNA-bindende Proteine in der Spleiß- oder Spleißverordnung11funktionieren, was die Grundlage für die anschließende Diskussion bilden wird.
Die zufällige Bibliothek: Wir haben eine zufällige Bibliothek mit 31 Nukleotiden verwendet. Die Längenbetrachtung für die zuzufällige Bibliothek beruhte lose auf der Idee, dass der allgemeine Spleißfaktor U2AF65 an eine Sequenz zwischen der Verzweigungspunktsequenz und der 3′ Spleißstelle bindet. Im Durchschnitt liegt der Abstand zwischen diesen Spleißsignalen in Metazoen im Bereich von 20 bis 40 Nukleotiden. Ein anderes Protein Sex-lethal war dafür bekannt, sich an eine schlecht charakterisierte regulatorische Sequenz in der Nähe der 3′ Spleißstelle seiner Ziel-Pre-mRNA, Transformator, zubinden. Daher wählten wir eine zufällige Region von 31 Nukleotiden, flankiert von Primerbindungsstellen mit Restriktionsenzymstellen, um die PCR-Verstärkung und Anhaftung des T7-RNA-Polymerase-Promotors für die In-vitro-Transkription zu ermöglichen. Die theoretische Bibliotheksgröße oder -komplexität betrug 431 oder ungefähr 1018. Wir verwendeten einen kleinen Bruchteil dieser Bibliothek, um unseren zufälligen RNA-Pool (1012-1015) für die unten beschriebenen Experimente vorzubereiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nukleinsäurebindende Proteine sind wichtige Regulatoren der Tier- und Pflanzenentwicklung. Eine wesentliche Voraussetzung für das SELEX-Verfahren ist die Entwicklung eines Assays, mit dem proteingebundene und ungebundene RNA-Fraktionen getrennt werden können. Im Prinzip kann dieser Assay ein In-vitro-Bindungstest wie der filterbindende Assay, der Gel-Mobilitäts-Shift-Assay oder ein Matrix-Bindungstest19 für rekombinante Proteine, gereinigte Proteine oder Proteinkomplexe sein. Der Assay kann a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt den National Institutes of Health für die bisherige Finanzierung.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
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