調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

Summary

配列特異性は遺伝子調節に不可欠です。特定の配列を認識する調節タンパク質は、遺伝子調節にとって重要です。このようなタンパク質に対する機能的結合部位の定義は、困難な生物学的問題である。RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための反復的アプローチをここに説明し、すべてのRNA結合タンパク質に適用可能である。

Abstract

遺伝子調節はすべての細胞で重要な役割を果たしています。転写、転写後(またはRNA処理)、翻訳、および翻訳後のステップは、特定の遺伝子を調節するために使用されます。配列特異的な核酸結合タンパク質は、空間的または時間的遺伝子発現を制御する特定の配列を標的とする。核酸中の結合部位は、典型的には変異分析によって特徴付けられる。しかしながら、目的の多数のタンパク質は、そのような特徴付けのための既知の結合部位を有していない。ここでは、RNA結合タンパク質に対する未知の結合部位を同定するアプローチについて説明する。これは、ランダム化されたシーケンスプールから始まるシーケンスの反復的な選択と増幅を含みます。これらのステップ転写、結合、増幅のいくつかのラウンドに続いて、濃縮された配列は、好ましい結合部位を識別するために配列される。このアプローチの成功は、インビトロ結合アッセイを用いてモニターされる。続いて、インビトロおよびインビボ機能アッセイを用いて、選択した配列の生物学的関連性を評価することができる。このアプローチにより、タンパク質結合型および非結合RNAを分離するアッセイが存在するRNA結合タンパク質に対して、以前に未知の結合部位の同定と特徴付けが可能になります。

Introduction

細胞生物学では、遺伝子調節が中心的な役割を果たします。遺伝子発現経路に沿った1つまたは複数のステップで、遺伝子は調節される可能性を持つ。これらのステップには、転写(開始、伸び、終了)、スプライシング、ポリアデニル化または3’エンド形成、RNAエクスポート、mRNA翻訳、および一次転写の減衰/局在化が含まれます。これらのステップでは、核酸結合タンパク質は遺伝子調節を調節する。このようなタンパク質に対する結合部位の同定は、遺伝子制御を研究する上で重要な側面である。突然変異解析と系統配列比較は、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化元素、および翻訳シグナル1などの核酸における調節配列またはタンパク質結合部位を発見するために使用されてきた。^2,3,4.

プレmRNAスプライシングは、遺伝子発現および調節中に不可欠なステップです。ヒトの哺乳類遺伝子を含む哺乳類の遺伝子の大半は、イントロンを持っています。これらの転写物の大部分は、代わりにスプライスされ、同じ遺伝子または一次転写産物から複数のmRNAおよびタンパク質アイソフォームを産生する。これらのアイソフォームは、細胞生物学において細胞特異的および発達的役割を持つ。5’スプライス部位、分岐点、およびポリピリミジン管/3’スプライス部位は、規制の対象となる重要なスプライシング信号です。否定的な規制では、そうでなければ強いスプライス部位が抑圧され、正の調節では弱いスプライス部位が活性化される。これらのイベントの組み合わせは、機能的に異なるアイソフォームの多くを生成します。RNA結合タンパク質は、これらの代替スプライシングイベントにおいて重要な役割を果たします。

多数のタンパク質が知られており、その結合部位またはRNA標的は5、6を同定されたままである。調節タンパク質を下流の生物学的標的または配列にリンクすることは、多くの場合、複雑なプロセスです。このようなタンパク質の場合、標的RNAまたは結合部位の同定は、その生物学的機能を定義する上で重要なステップである。結合部位が同定されると、標準的な分子および生化学的分析を用いてさらに特徴付けることができる。

ここで説明する方法には、2 つの利点があります。まず、目的のタンパク質に対して未知の結合部位を同定することができる。第二に、このアプローチの付加的な利点は、同時に飽和変異を可能にし、それ以外の場合は結合部位内の配列要件に関する同等の情報を得るために労働集約的であろうということです。従って、RNAのタンパク質結合部位を同定するためのより速く、より簡単で、より低コストのツールを提供する。本来、このアプローチ(EXponential enrichmentによるリガンドのSELEXまたは系統的進化)は、独自のmRNAにおけるリボソーム結合部位と重複するバクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ(遺伝子43タンパク質)の結合部位を特徴付けるために使用された。バインディング部位には 8 ベースのループ シーケンスが含まれており、分析⁷の 65,536 個のランダム化バリアントを表します。第二に、このアプローチはまた、異なる染料に対する特定の結合部位またはアプタマーが約10¹³配列8のプールから選択できることを示すために独立して使用された。実際、このアプローチは、タンパク質、小分子、細胞などの多数のリガンドを結合するためのアプタマー(RNAまたはDNA配列)を同定し、^触媒9のために多くの異なる文脈で広く使用されてきました。一例として、アプタマーは、カフェ^イン10中の1つのメチル基の存在によって異なる2つのキサンチン誘導体、カフェインおよびテオフィリンを区別することができる。我々は、このアプローチ(SELEXまたは反復選択増幅)を広く使用して、RNA結合タンパク質がスプライシングまたはスプライシング^調節11でどのように機能するかを研究しました。

ランダムライブラリ:我々は31ヌクレオチドのランダムライブラリを使用しました。ランダムライブラリの長さの考慮は、一般的なスプライシング係数U2AF⁶⁵が分岐点配列と3’スプライス部位の間のシーケンスに結合するという考えに大まかに基づいていました。平均して、メタゾンにおけるこれらのスプライシング信号間の間隔は、20〜40ヌクレオチドの範囲にある。別のタンパク質セックス致死性は、その標的前mRNA、変圧器の3’スプライス部位付近の不十分な特徴付け調節配列に結合することが知られていた。したがって、我々は31ヌクレオチドのランダム領域を選択し、制限酵素部位を有するプライマー結合部位によって横たわって、インビトロ転写のためのT7 RNAポリメラーゼプロモーターのPCR増幅および付着を可能にした。理論的なライブラリのサイズまたは複雑さは 4³¹または約 10¹⁸.このライブラリのほんの一部を使用して、以下に説明する実験のためにランダムRNAプール(~10 12-10¹⁵⁾を準備しました。

Protocol

注:図 1は、反復選択増幅 (SELEX) プロセスの主要な手順の概要を示しています。 1. ランダムライブラリテンプレートの生成 DNAシンセサイザー上の化学合成により、前方プライマー5′-GTAATCAGGTCAGATCTGATCCA-3’と逆プライマー5′-GCGACGGATCCAAGCTTCA-3’を合成します。 注:プライマーとランダムライブラリは、商業的に合成することができます。</l…

Representative Results

以下の観察は、選択増幅(SELEX)の成功を示しています。まず、プール0と選択した配列を分析し、反復選択増幅アプローチに使用するタンパク質に結合する。図2は、哺乳動物ポリピリミジン管結合タンパク質(PTB)が、選択された配列プールに対してプール0配列に対してほとんど検出可能であるが、高い親和性を示すことを示す。選択したプールに?…

Discussion

核酸結合タンパク質は、動物および植物の発達の重要な調節剤である。SELEX手順の重要な要件は、タンパク質結合および非結合RNA画分分を分離するために使用できるアッセイの開発です。原理的には、このアッセイは、フィルタ結合アッセイ、ゲル移動シフトアッセイ、または組換えタンパク質、精製タンパク質、またはタンパク質複合体に対するマトリックス結合アッ^{セイ19</s…}

Materials

Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard