Explorar el espacio de secuencia para identificar sitios de unión para proteínas reguladoras que unen el ARN
Summary
La especificidad de la secuencia es fundamental para la regulación genética. Las proteínas reguladoras que reconocen secuencias específicas son importantes para la regulación genética. Definir sitios de unión funcional para tales proteínas es un problema biológico desafiante. Aquí se describe un enfoque iterativo para la identificación de un sitio de unión para una proteína de unión al ARN y es aplicable a todas las proteínas de unión al ARN.
Abstract
La regulación genética desempeña un papel importante en todas las células. Los pasos transcripcionales, post-transcripcionales (o procesamiento de ARN), traslacionales y post-traduccionales se utilizan para regular genes específicos. Las proteínas de unión a ácido nucleico específicas de la secuencia se dirigen a secuencias específicas para controlar la expresión génica espacial o temporal. Los sitios de unión en los ácidos nucleicos se caracterizan típicamente por el análisis mutacional. Sin embargo, numerosas proteínas de interés no tienen un sitio de unión conocido para tal caracterización. Aquí describimos un enfoque para identificar sitios de unión previamente desconocidos para proteínas de unión al ARN. Implica la selección iterativa y la amplificación de secuencias a partir de un grupo de secuencias aleatorio. Después de varias rondas de estos pasos de transcripción, enlace y amplificación, las secuencias enriquecidas se secuencian para identificar un sitio o sitios de enlace preferidos. El éxito de este enfoque se supervisa mediante ensayos de unión in vitro. Posteriormente, se pueden utilizar ensayos funcionales in vitro e in vivo para evaluar la relevancia biológica de las secuencias seleccionadas. Este enfoque permite la identificación y caracterización de un sitio o sitios de unión previamente desconocidos para cualquier proteína de unión al ARN para la cual existe un ensayo para separar los ARN unidos a proteínas y sin unir.
Introduction
En la biología celular, la regulación genética juega un papel central. En uno o varios pasos a lo largo de la vía de expresión génica, los genes tienen el potencial de ser regulados. Estos pasos incluyen transcripción (iniciación, alargamiento y terminación), así como empalme, poliadenilación o formación final de 3′, exportación de ARN, traducción de ARNm y decaimiento/localización de transcripciones primarias. En estos pasos, las proteínas de unión a ácido nucleico modulan la regulación genética. La identificación de sitios de unión para tales proteínas es un aspecto importante del estudio del control genético. El análisis mutacional y la comparación de secuencias filogenéticas se han utilizado para descubrir secuencias reguladoras o sitios de unión a proteínas en ácidos nucleicos, como promotores, sitios de empalme, elementos de poliadenilación y señales traslacionales1, 2 , 3 , 4.
El empalme pre-mRNA es un paso integral durante la expresión y regulación del gen. La mayoría de los genes de mamíferos, incluidos los de los seres humanos, tienen intrones. Una gran fracción de estas transcripciones se empalma alternativamente, produciendo múltiples isoformas de ARNm y proteínas del mismo gen o transcripción primaria. Estas isoformas tienen funciones específicas de la célula y del desarrollo en la biología celular. El sitio de empalme de 5′, el punto de bifurcación y el sitio de empalme polypyrimidine-tract/3′ son señales de empalme críticas que están sujetas a regulación. En la regulación negativa, se reprime un sitio de empalme fuerte, mientras que en la regulación positiva se activa un sitio de empalme débil. Una combinación de estos eventos produce una plétora de isoformas funcionalmente distintas. Las proteínas de unión al ARN desempeñan un papel clave en estos eventos de empalme alternativo.
Numerosas proteínas se conocen cuyos sitios de unión o dianas de ARN permanecen por identificar5,6. Vincular las proteínas reguladoras a sus objetivos biológicos o secuencias aguas abajo es a menudo un proceso complejo. Para estas proteínas, la identificación de su ARN objetivo o sitio de unión es un paso importante en la definición de sus funciones biológicas. Una vez que se identifica un sitio de unión, se puede caracterizar mediante análisis moleculares y bioquímicos estándar.
El enfoque descrito aquí tiene dos ventajas. En primer lugar, puede identificar un sitio de unión previamente desconocido para una proteína de interés. En segundo lugar, una ventaja añadida de este enfoque es que simultáneamente permite la mutagénesis de saturación, que de otro modo sería laboriosa para obtener información comparable sobre los requisitos de secuencia dentro del sitio de enlace. Por lo tanto, ofrece una herramienta más rápida, fácil y menos costosa para identificar sitios de unión a proteínas en el ARN. Originalmente, este enfoque (SELEX o Evolución Sistemática de los Ligandos por enriquecimiento EXponential) se utilizó para caracterizar el sitio de unión para la bacteriófago T4 ADN polimerasa (proteína gen 43), que se superpone con el sitio de unión ribosoma en su propio ARNm. El sitio de enlace contiene una secuencia de bucle de 8 bases, que representa 65.536 variantes aleatorias para el análisis7. En segundo lugar, el enfoque también se utilizó de forma independiente para mostrar que se pueden seleccionar sitios deenlace o aptámeros específicos para diferentes colorantes de un grupo de aproximadamente 1013 secuencias 8. De hecho, este enfoque se ha utilizado ampliamente en muchos contextos diferentes para identificar aptámeros (secuencias de ARN o ADN) para unirnumerosos ligandos, como proteínas, moléculas pequeñas y células, y para la catálisis 9. Por ejemplo, un aptámero puede discriminar entre dos derivados de la xantina, la cafeína y la teofilina, que difieren por la presencia de un grupo metilo en la cafeína10. Hemos utilizado ampliamente este enfoque (SELEX o selección iterativa-amplificación) para estudiar cómo funcionan las proteínas de unión al ARN en la regulación11de empalme o empalme, que será la base de la discusión a continuación.
La biblioteca aleatoria: Usamos una biblioteca aleatoria de 31 nucleótidos. La consideración de longitud para la biblioteca aleatoria se basó libremente en la idea de que el factor de empalme general U2AF65 se une a una secuencia entre la secuencia de punto de bifurcación y el sitio de empalme de 3′. En promedio, el espaciado entre estas señales de empalme en metazoos está en el rango de 20 a 40 nucleótidos. Otra proteína Sex-lethal era conocido por unirse a una secuencia reguladora mal caracterizada cerca del sitio de empalme de 3′ de su objetivo pre-mRNA, transformador. Por lo tanto, elegimos una región aleatoria de 31 nucleótidos, flanqueados por sitios de unión de imprimación con sitios de enzimas de restricción para permitir la amplificación de PCR y la unión del promotor de la polimerasa de ARN T7 para la transcripción in vitro. El tamaño o la complejidad de la biblioteca teórica era de 431 o aproximadamente 1018. Usamos una pequeña fracción de esta biblioteca para preparar nuestra piscina de ARN aleatoria (1012-1015) para los experimentos que se describen a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las proteínas de unión a ácido sulfúrico son reguladores importantes del desarrollo animal y vegetal. Un requisito clave para el procedimiento SELEX es el desarrollo de un ensayo que se puede utilizar para separar las fracciones de ARN unidas a proteínas y no unidas. En principio, este ensayo puede ser un ensayo de unión in vitro, como el ensayo de unión al filtro, el ensayo de cambio de movilidad de gel o un ensayo de unión de matriz19 para proteínas recombinantes, proteínas purificadas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor agradece a los Institutos Nacionales de Salud por la financiación pasada.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
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