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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Explorar el espacio de secuencia para identificar sitios de unión para proteínas reguladoras que unen el ARN

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59635
Automatic Translation
1
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

Summary

La especificidad de la secuencia es fundamental para la regulación genética. Las proteínas reguladoras que reconocen secuencias específicas son importantes para la regulación genética. Definir sitios de unión funcional para tales proteínas es un problema biológico desafiante. Aquí se describe un enfoque iterativo para la identificación de un sitio de unión para una proteína de unión al ARN y es aplicable a todas las proteínas de unión al ARN.

Abstract

La regulación genética desempeña un papel importante en todas las células. Los pasos transcripcionales, post-transcripcionales (o procesamiento de ARN), traslacionales y post-traduccionales se utilizan para regular genes específicos. Las proteínas de unión a ácido nucleico específicas de la secuencia se dirigen a secuencias específicas para controlar la expresión génica espacial o temporal. Los sitios de unión en los ácidos nucleicos se caracterizan típicamente por el análisis mutacional. Sin embargo, numerosas proteínas de interés no tienen un sitio de unión conocido para tal caracterización. Aquí describimos un enfoque para identificar sitios de unión previamente desconocidos para proteínas de unión al ARN. Implica la selección iterativa y la amplificación de secuencias a partir de un grupo de secuencias aleatorio. Después de varias rondas de estos pasos de transcripción, enlace y amplificación, las secuencias enriquecidas se secuencian para identificar un sitio o sitios de enlace preferidos. El éxito de este enfoque se supervisa mediante ensayos de unión in vitro. Posteriormente, se pueden utilizar ensayos funcionales in vitro e in vivo para evaluar la relevancia biológica de las secuencias seleccionadas. Este enfoque permite la identificación y caracterización de un sitio o sitios de unión previamente desconocidos para cualquier proteína de unión al ARN para la cual existe un ensayo para separar los ARN unidos a proteínas y sin unir.

Introduction

En la biología celular, la regulación genética juega un papel central. En uno o varios pasos a lo largo de la vía de expresión génica, los genes tienen el potencial de ser regulados. Estos pasos incluyen transcripción (iniciación, alargamiento y terminación), así como empalme, poliadenilación o formación final de 3', exportación de ARN, traducción de ARNm y decaimiento/localización de transcripciones primarias. En estos pasos, las proteínas de unión a ácido nucleico modulan la regulación genética. La identificación de sitios de unión para tales proteínas es un aspecto importante del estudio del control genético. El análisis mutacional y la comparación de secuencias filogenéticas se han utilizado para descubrir secuencias reguladoras o sitios de unión a proteínas en ácidos nucleicos, como promotores, sitios de empalme, elementos de poliadenilación y señales traslacionales1, 2 , 3 , 4.

El empalme pre-mRNA es un paso integral durante la expresión y regulación del gen. La mayoría de los genes de mamíferos, incluidos los de los seres humanos, tienen intrones. Una gran fracción de estas transcripciones se empalma alternativamente, produciendo múltiples isoformas de ARNm y proteínas del mismo gen o transcripción primaria. Estas isoformas tienen funciones específicas de la célula y del desarrollo en la biología celular. El sitio de empalme de 5', el punto de bifurcación y el sitio de empalme polypyrimidine-tract/3' son señales de empalme críticas que están sujetas a regulación. En la regulación negativa, se reprime un sitio de empalme fuerte, mientras que en la regulación positiva se activa un sitio de empalme débil. Una combinación de estos eventos produce una plétora de isoformas funcionalmente distintas. Las proteínas de unión al ARN desempeñan un papel clave en estos eventos de empalme alternativo.

Numerosas proteínas se conocen cuyos sitios de unión o dianas de ARN permanecen por identificar5,6. Vincular las proteínas reguladoras a sus objetivos biológicos o secuencias aguas abajo es a menudo un proceso complejo. Para estas proteínas, la identificación de su ARN objetivo o sitio de unión es un paso importante en la definición de sus funciones biológicas. Una vez que se identifica un sitio de unión, se puede caracterizar mediante análisis moleculares y bioquímicos estándar.

El enfoque descrito aquí tiene dos ventajas. En primer lugar, puede identificar un sitio de unión previamente desconocido para una proteína de interés. En segundo lugar, una ventaja añadida de este enfoque es que simultáneamente permite la mutagénesis de saturación, que de otro modo sería laboriosa para obtener información comparable sobre los requisitos de secuencia dentro del sitio de enlace. Por lo tanto, ofrece una herramienta más rápida, fácil y menos costosa para identificar sitios de unión a proteínas en el ARN. Originalmente, este enfoque (SELEX o Evolución Sistemática de los Ligandos por enriquecimiento EXponential) se utilizó para caracterizar el sitio de unión para la bacteriófago T4 ADN polimerasa (proteína gen 43), que se superpone con el sitio de unión ribosoma en su propio ARNm. El sitio de enlace contiene una secuencia de bucle de 8 bases, que representa 65.536 variantes aleatorias para el análisis7. En segundo lugar, el enfoque también se utilizó de forma independiente para mostrar que se pueden seleccionar sitios deenlace o aptámeros específicos para diferentes colorantes de un grupo de aproximadamente 1013 secuencias 8. De hecho, este enfoque se ha utilizado ampliamente en muchos contextos diferentes para identificar aptámeros (secuencias de ARN o ADN) para unirnumerosos ligandos, como proteínas, moléculas pequeñas y células, y para la catálisis 9. Por ejemplo, un aptámero puede discriminar entre dos derivados de la xantina, la cafeína y la teofilina, que difieren por la presencia de un grupo metilo en la cafeína10. Hemos utilizado ampliamente este enfoque (SELEX o selección iterativa-amplificación) para estudiar cómo funcionan las proteínas de unión al ARN en la regulación11de empalme o empalme, que será la base de la discusión a continuación.

La biblioteca aleatoria: Usamos una biblioteca aleatoria de 31 nucleótidos. La consideración de longitud para la biblioteca aleatoria se basó libremente en la idea de que el factor de empalme general U2AF65 se une a una secuencia entre la secuencia de punto de bifurcación y el sitio de empalme de 3'. En promedio, el espaciado entre estas señales de empalme en metazoos está en el rango de 20 a 40 nucleótidos. Otra proteína Sex-lethal era conocido por unirse a una secuencia reguladora mal caracterizada cerca del sitio de empalme de 3' de su objetivo pre-mRNA, transformador. Por lo tanto, elegimos una región aleatoria de 31 nucleótidos, flanqueados por sitios de unión de imprimación con sitios de enzimas de restricción para permitir la amplificación de PCR y la unión del promotor de la polimerasa de ARN T7 para la transcripción in vitro. El tamaño o la complejidad de la biblioteca teórica era de 431 o aproximadamente 1018. Usamos una pequeña fracción de esta biblioteca para preparar nuestra piscina de ARN aleatoria (1012-1015) para los experimentos que se describen a continuación.

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Protocol

NOTA: La Figura 1 proporciona un resumen de los pasos clave en el proceso de selección-amplificación iterativa (SELEX).

1. Generación de una plantilla de biblioteca aleatoria

  1. Sintetizar la imprimación delantera 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' y la imprimación inversa 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' por síntesis química en un sintetizador de ADN.
    NOTA: Las imprimaciones y la biblioteca aleatoria se pueden sintetizar comercialmente.
  2. Sintetizar una plantilla de oligonucleótido biblioteca aleatoria 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N1... N31)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' por síntesis química. Utilice una mezcla equimolar de cuatro fosforamiditas durante la síntesis para las 31 posiciones aleatorias mostradas anteriormente como N.
    NOTA: La secuencia de la plantilla de biblioteca contiene 31 nucleótidos aleatorios (N1 a N31) y secuencias de flanqueo para la unión de las imprimaciones delantera sano e inversa. La imprimación directa incluye la secuencia promotora de la polimerasa de ARN T7 (subrayada) para la transcripción in vitro y un sitio de restricción Bcl1 (en cursiva) para la clonación. La imprimación inversa contiene los sitios de enzimas de restricción BamH1 y HindIII (en cursiva) para facilitar la clonación.

2. Generación de la piscina de bibliotecas aleatorias de ADN

  1. Adjunte el promotor de la polimerasa de ARN T7 a la biblioteca por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que contenga una plantilla de biblioteca aleatoria de ADN de 1 m, 1 M de cada imprimación, Tris de 20 mM (pH 8,0), MgCl2de 1,5 mM, KCl de 50 mM, albúmina de suero bovino aceilado de 0,1 g/L, 2 unidades de Taq< /c1> polimerasa, y 200 m cada uno de dNtPs (desoxiguanosina, desoxiadenosina, desoxicitotidina y trifosfato de desoxitimidina).
  2. Utilizar cinco ciclos de desnaturalización, recocido y pasos de extensión (94 oC durante 1 min, 53 oC durante 1 min y 72 oC durante 1 min) de PCR seguidos de un ciclo de extensión (72 oC durante 10 min).

3. Síntesis del ARN de la piscina 0

  1. Configure una reacción de transcripción de 100 l12. Mezclar tampón de transcripción T7, 1 M de ADN de la piscina de biblioteca aleatoria, ditiothreitol de 5 mM (TDT), trifosfato de guanosina de 2 mM (GTP), 1 mM cada uno de trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de citidina (CTP) y trifosfato de uridina (UTP) y 2 unidades/L T7 de ARNpoliasa.
    NOTA: El ARN se puede transcribir in vitro utilizando kits disponibles comercialmente con una opción de la polimerasa de ARN T7 o SP6.
  2. Incubar la mezcla de reacción anterior en un tubo de microcentrífuga durante 2 h a 37 oC.
  3. Gel purifica el ARN en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10%.
  4. Identificar la ubicación de las transcripciones en el gel tintándolo con azul de metileno o autoradiografía incluyendo rastros de radiactividad (0,5 l o menos de UTP de32P) en la reacción de transcripción.
    1. Coloque la rodaja de gel en un tubo centrífugo y rompa en trozos más pequeños, por ejemplo, con una punta homogeneizadora. Añadir tampón de proteinasa K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% sulfato de dodecilo sódico) para sumergir las piezas de gel. Deje el tubo en un nutator de 2 h hasta pernoctar a temperatura ambiente.
  5. Girar en una microcentrífuga de alta velocidad (14.000 rpm o 16.873 x g) durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos de gel y recuperar la solución tampón.
  6. Vortex la muestra dos veces con un volumen igual de fenol-cloroformo y una vez con cloroformo.
  7. Mezclar la fase acuosa desde arriba con un décima parte de acetato de sodio (3,0 M, pH 5,2), 10 g de ARNm o 20 g de glucógeno, y etanol (2-3 volúmenes, almacenados a -20 oC). Dejar los tubos a -80oC durante 1 h.
  8. Girar los tubos que contienen la solución durante 5-10 min a 4 oC en una microcentrífuga (14.000 rpm o 16.873 x g). Deseche el sobrenadante cuidadosamente. Enjuague el pellet de ARN con 70% de etanol y gire durante 2-5 min. Aspirar el etanol con cuidado. Seque al aire el pellet de ARN.
  9. Solubilizar el pellet de ARN en 50 l de agua tratada con pircarbonato dietílico (DEPC). Deje la muestra a -20 oC para el almacenamiento.
    NOTA: Purificar el ARN utilizando columnas de espín disponibles comercialmente, que actualmente se utilizan más comúnmente para eliminar la radiactividad no incorporada y servir como una alternativa rápida y más conveniente para la purificación del ARN.
    ADVERTENCIA: Utilice un escudo de vidrio acrílico, guantes y otras precauciones para protegerse de la radiactividad.

4. Reacción de unión a proteínas y separación del ARN unido

  1. Llevar a cabo la unión de proteínas y ARN en 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 en un volumen de 100 l añadiendo los siguientes ingredientes a estas concentraciones finales: 50 mM KCl, 1 mM de TDT, 0,09 g/L de albúmina de suero bovino, 0,5 unidades/L de RNasin, 0,15 g/L de tRNA , 1 mM de EDTA y 30 ml de concentración adecuada de proteína recombinante (PTB). Agregue el ARN de la piscina apropiada.
    NOTA: El factor de empalme U2AF65 normalmente se une a los sitios de empalme de polipirimidina-tracto/3' de los intrones del modelo con una afinidad de unión (constante de disociación de equilibrio o Kd) de aproximadamente 1–10 nM. Por lo tanto, las dos primeras rondas de unión utilizaron la concentración de proteína 10 veces por encima de la Kd para U2AF65; para las proteínas SXL y PTB, la concentración inicial en este rango fue sólo nuestra mejor conjetura. Esto aseguró que las especies de ARN deseadas que pudieran unirse, aunque las secuencias de afinidad más bajas también podrían estar potencialmente unidas. En las rondas 3 y 4 (transcripción, unión y amplificación), la concentración de proteínas se redujo tres veces (Paso 4.1). Esto se hizo para eliminar sucesivamente las especies de ARN de baja afinidad.
  2. Colocar los tubos que contienen las reacciones de unión durante unos 30 minutos a 25 oC en un bloque de temperatura (o sobre hielo).
  3. Fraccionar el ARN enlazado del ARN no enlazado durante las primeras 4 rondas de selección-amplificación siguiendo los siguientes pasos.
    1. Filtrar la muestra (100 l) a temperatura ambiente a través de un filtro de nitrocelulosa unido a un colector de vacío.
      NOTA: El complejo de proteína de ARN, pero no el ARN no enlazado, permanece en el filtro.
    2. Cortar el filtro con ARN retenido en fragmentos con una cuchilla de afeitar estéril; insertarlos en un tubo de centrífuga. Recuperar el ARN cayendo el tubo suavemente durante un mínimo de 3 h (o durante la noche) con piezas de filtro sumergidas en el tampón de proteinasa K (PK).
    3. Desproteinizar la muestra de ARN vórtina en presencia de un volumen igual de fenol-cloroformo (1:1) y luego de cloroformo. Recupere la fase acuosa cada vez centrifugando la muestra a alta velocidad durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    4. Mezclar con acetato de sodio (0,1 volumen de 3,0 M, pH 5,2) y etanol (2-3 volúmenes de etanol absoluto, a prueba de 200). Dejar el tubo en un congelador de -80 oC durante 30 minutos, centrifugarlo a alta velocidad durante 10 minutos y, siguiendo los pasos de lavado y secado (paso 3.8), solubilizar el ARN en agua tratada con DEPC. Estos pasos se describen anteriormente (pasos 3.6 a 3.9).
  4. Separe las fracciones de ARN ligadas a proteínas de las fracciones no enlazadas para las últimas 2 rondas (rondas 5 y 6; transcripción, unión y amplificación) de la siguiente manera. Reduzca la concentración de proteínas en la reacción de unión (paso 4.1) por tres veces más para una presión de selección adicional para enriquecer las secuencias de unión de alta afinidad y eliminar preferentemente las secuencias de baja afinidad.
    1. Pre-fundó un gel de poliacrilamida nativo (5% con 60:1 relación acrilamida:bis-acrilamida) en un tampón TBE de 0,5x (Tris-Borate-EDTA) antes de configurar la reacción de ARN:proteína-unión anterior (paso 4.1). Electroforrese este gel en una cámara frigorífica (4oC) aplicando 250 V durante 15 min.
    2. Pipetear las reacciones de unión de proteínas:ARN anteriores (paso 4.1) en diferentes pozos de este gel.
      NOTA: La proteína se almacena a -80 oC y se diluye antes de su uso en 20 mM 4-(2-Hidroxietilo)piperazina-1-ácido etanesulfónico (HEPES), pH 8,0, 20% glicerol, 0,2 mM ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), 0,05% NP-40 y 1 mM de dithiothreititita( DTT). La adición de 0.5–1.0 mM inhibidor de la proteasa fenilmetano fluoruro de sulfonil (PMSF) es opcional. En la reacción de unión, este tampón aporta alrededor del 6% de glicerol, lo que permite la carga directa de muestras en los pozos sin necesidad de mezclarlas con un tampón de carga de gel separado.
    3. Fraccionar el ARN unido del ARN no unido utilizando electroforesis de gel en una cámara fría (4 oC) a 250 V durante 1 a 2 h. Este proceso también se conoce como ensayo de cambio de movilidad en gel.
      NOTA: La duración de la electroforesis varía en función de las características del ARN y la proteína utilizada para la unión.
    4. Exponga el gel a una película de rayos X e identifique la ubicación del ARN enlazado mediante autoradiografía. Corte la rebanada de gel con el ARN unido e insértela en un tubo.
    5. Incubar la rodaja de gel triturada en el tampón PK utilizado para la elución durante 3 h o durante la noche.
    6. Repita los pasos 3.5 a 3.9 descritos anteriormente. Brevemente, vórtice la muestra de ARN eluida vigorosamente primero con fenol-cloroformo y luego con cloroformo.
    7. Mezclar acetato de sodio y etanol con la fase acuosa después de la extracción de cloroformo. Después de la incubación en el congelador de -80 oC, girar a 4 oC durante 5-10 min para recoger el pellet de ARN. Lave el pellet de ARN con etanol y séquelo al aire dejando la tapa del tubo abierta. Disolver el ARN en agua tratada con DEPC.
      NOTA: Cambiar al ensayo de cambio de movilidad de gel para fraccionamiento permite la eliminación de especies de ARN no deseados que podrían haber sido enriquecidas para unirse, por ejemplo, al filtro de nitrocelulosa aquí (o a cualquier matriz) utilizado en las rondas iniciales para el fraccionamiento.

5. Transcripción inversa y amplificación de PCR

  1. Sintete el ADNc a partir del ARN disuelto utilizando la transcriptasa inversa y la imprimación inversa incubando la reacción de 20 l (2 l de tampón RT de 10x, 2 ml de transcriptasa inversa AMV, imprimación inversa de 1 M, 10 ml de ARN, inhibidor de la rnalosa opcional) a 42 oC durante 60 min.
  2. Amplifique el ADNc utilizando ciclos de PCR de 20 a 25, como se describe en el paso 2.1.

6. Transcripción y unión a proteínas

  1. Repetir el proceso de síntesis de ARN, unión a proteínas, separación de proteína sin unir y fracción no unida, como se describe en la sección 3–5 anterior.

7. Análisis de las interacciones ARN-proteína

  1. Utilice el ensayo de desplazamiento de movilidad de gel (paso 4.4) o el ensayo de unión de filtro (paso 4.3) para determinar la afinidad y especificidad de unión para agrupaciones seleccionadas o secuencias individuales dentro de cada grupo (consulte el paso 8.3).
  2. Utilice la autoradiografía o un imager de fósforo para detectar y cuantificar las bandas en la fracción enlazada y la fracción no enlazada.

8. Clonación y secuenciación

  1. Digerir el producto final de ADN PCR con enzimas de restricción Bcl1 y HindIII durante 1–2 h, ligada con el pGEM3 adecuadamente digerido u otros plásmidos que transportan los sitios de restricción de 2 h a la noche, transformar el producto de ligación en células bacterianas competentes por choque de calor o electroporación utilizando procedimientos de biología molecular estándar13.
  2. Cultivar las bacterias durante la noche enchapando las células transformadas en placas de agar con medio luria-bertani (LB) y ampicilina (50 g/ml) a 37 oC. Recoger colonias para inocular tubos de cultivo que contengan medio líquido LB con ampicilina y crecer a 37 oC en una incubadora de temblores durante la noche. Purificar los ADN plásmidos que contienen inserciones de ADN utilizando un protocolo de aislamiento plásmido estándar13.
    NOTA: Los kits comerciales están disponibles para purificación de plásmidos.
  3. Secuenciar los plásmidos con inserciones de ADN utilizando el protocolo de secuenciación de terminación de cadena dideoxi, siguiendo las instrucciones del fabricante para la secuenciación14.
    NOTA: La secuenciación se puede realizar en casa o hacer comercialmente.

9. Alineación de la secuencia

  1. Alinee las secuencias y obtenga un sitio o sitios de enlace de consenso utilizando las herramientas de alineación en línea disponibles
    (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

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Representative Results

Las siguientes observaciones demuestran una selección-amplificación exitosa (SELEX). En primer lugar, analizamos la agrupación 0 y las secuencias seleccionadas para unirse a la proteína utilizada para el enfoque iterativo de selección-amplificación. La Figura 2 muestra que la proteína de unión de tracto de polipirimidina (PTB) de mamíferos muestra una unión apenas detectable a la secuencia del grupo 0, pero una alta afinidad para el grupo de secuencias seleccionado. Apenas había unión detectable a la piscina 0 cuando usamos una concentración de proteína según 300 veces mayor para la unión que la utilizada para la piscina seleccionada. Por lo tanto, hubo al menos varios cientos de diferencias en las afinidades de unión a proteínas entre la piscina aleatoria o inicial y la piscina seleccionada. Esta observación confirma experimentalmente que el protocolo de selección-amplificación descrito aquí es exitoso.

En segundo lugar, secuenciamos el grupo seleccionado y determinamos un sitio de enlace de consenso. La secuencia de consenso obtenida de la alineación de la mayoría de las secuencias seleccionadas de la agrupación seleccionada por PTB de mamíferos fue: GCCUG(Y/G)UGCYYYYCYYYG(Y/G)CCC. Esto muestra que hemos seleccionado secuencias únicas ricas en pirimidina que enlazan PTB11. Cuando realizamos la selección-amplificación iterativa para el dominio de enlace de ARN de la DROsophila PTB, enriquecimos secuencias ricas en CU interrumpidas por guanosinas. Entre las secuencias de alta afinidad que seleccionó la Drosophila PTB había una secuencia rica en pirimidina al 84%: GCUUUCCUCUGUCGCCCUUCUUCGUCCCCUG. De hecho, esta secuencia es similar a la secuencia rica en pirimidina presente en el intron alfa-tropomiosina que se une con alta afinidad y está regulada por el mamífero PTB15. Hemos utilizado con éxito este enfoque repetidamente para estudiar las propiedades y funciones de unión al ARN que nivelan los reguladores y un factor de empalme11,15,16. La Tabla 1 muestra ejemplos exitosos de proteínas de unión al ARN para las que SELEX se utilizó para identificar sus sitios de unión preferidos o de consenso.

En tercer lugar, un ensayo de empalme in vitro, que se basa en la elección alternativa de sitio de empalme de 3', muestra la relevancia funcional de especificidades distintas pero superpuestas de unión al ARN de proteínas de unión de tracto de polipirimidina. Mientras que un sitio de empalme ascendente de 3' se utiliza de forma predeterminada, la adición de la PTB recombinante conduce a la activación del sitio de empalme alternativo o descendente de 3' (Figura3). Por el contrario, la adición de hnRNP C17 recombinante conduce a la represión de ambos sitios de empalme de 3'. La adición del factor de empalme general recombinante U2AF65 invierte la represión delsitio de empalme de 3' mediada por hnRNP C1 (Figura 3), así como el efecto mediado por PTB en la activación del sitio de empalme descendente de 3' (no se muestran los datos). Una explicación simple de estos efectos es una competencia directa entre la unión del factor de empalme general U2AF65 y PTB (también llamado hnRNP I), que vincula y reprime preferentemente ciertos sitios de empalmes de 3', o entre U2AF65 y hnRNP C, que se une y reprime los dos sitios de empalme de 3'.

Figure 1
Figura 1: Resumen de los pasos clave en el proceso iterativo de selección-amplificación (SELEX). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Enriquecimiento de ARN de enlace DE PTB. El aumento de la concentración (triángulos rellenos) de PTB recombinante se utilizó con ARN de la piscina 0 radiomarcado o con la agrupación seleccionada obtenida después de seis rondas de selección y amplificación. Se indican las posiciones de ARN no unido y el complejo ARN:proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El ensayo de conmutación de sitios de empalme valida distintas especificidades de unión de proteínas de unión a pirimidina. (A-Top) Esquemas del sustrato de empalme. El sustrato de empalme contiene un sitio de empalme de 5' y dos sitios de empalme alternativos de 3' que flanquean el intrón. Los rectángulos (abiertos, con líneas horizontales y sólidos) son exons y la línea es un intron. (A-Inferior) hnRNP C1 reprime el sitio de empalme ascendente de 3' (sin activación del sitio de empalme descendente de 3'), mientras que ptB conduce a la activación del sitio de empalme descendente de 3'. El sustrato de empalme fue incubado en un extracto nuclear de células de HeLa. Los productos de empalme (mostrados en los lados) se analizaron utilizando un ensayo de extensión de imprimación18 con imprimaciones de unión de empalme (flechas), que reconocen el empalme del sitio de empalme común de 5' ya sea en el sitio de empalme ascendente o descendente de 3'. (B) U2AF65 recombinante (rU2AF65) invierte el efecto represivo de hnRNP C1. La adición de las proteínas hnRNP C1, PTB o rU2AF65 recombinantes a la reacción de empalme está indicada por los símbolos +. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proteína Secuencia(s) preferida(s)
U2AF65 Cs que contienen Cs
Sxl U-rich que contiene 2-4 Gs
Ptb UCUUC rico en algunos Gs
hnRNP C1 Rico en U (5-6 de largo)
CstF64 Rico en GU
hnRNP E1/E2 y K C-rich
U2AF65/U2AF35 heterodimer UUUYYYYYUNUAGGU

Tabla 1: Sitios de unión preferidos para algunas proteínas de unión al ARN.

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Discussion

Las proteínas de unión a ácido sulfúrico son reguladores importantes del desarrollo animal y vegetal. Un requisito clave para el procedimiento SELEX es el desarrollo de un ensayo que se puede utilizar para separar las fracciones de ARN unidas a proteínas y no unidas. En principio, este ensayo puede ser un ensayo de unión in vitro, como el ensayo de unión al filtro, el ensayo de cambio de movilidad de gel o un ensayo de unión de matriz19 para proteínas recombinantes, proteínas purificadas o complejos de proteínas. El ensayo también puede ser un ensayo enzimático en el que los precursores y productos (o productos intermedios) pueden separarse en función del tamaño o de algunos otros medios20.

Mientras que la mutagénesis se ha utilizado ampliamente para caracterizar los sitios de unión de proteínas, es laboriosa, y las secuencias lentas y más largas no son tan fácilmente susceptibles a la mutagénesis de saturación. La importancia del enfoque iterativo de enlace y amplificación descrito aquí es que no sólo supera algunas de las limitaciones anteriores, puede identificar lo más importante sitios de enlace previamente desconocidos y proporcionar información importante sobre nucleótidos en cada posición al mismo tiempo.

Una consideración importante para el éxito de la selección iterativa-amplificación es la afinidad y especificidad vinculantes. Típicamente, se emplean de 12 a 15 rondas de selección-amplificación y se puede muestrear rutinariamente un espacio de secuencia de 1012 a 1015 moléculas. El progreso y el éxito final del protocolo de selección-amplificación se pueden supervisar mediante un ensayo de enlace o una secuencia directa, que supervisa la afinidad o el enriquecimiento de secuencias específicas en agrupaciones intermedias, respectivamente. Si bien el ensayo vinculante se utilizaba tradicionalmente, la llegada de la secuenciación de próxima generación permite analizar el enriquecimiento de secuencias de maneras no posibles mediante la secuenciación manual de Sanger14.

Un paso crítico en el éxito de SELEX es el enriquecimiento de plegado de las moléculas deseadas en cada paso. El número de ciclos requeridos para SELEX varía y depende de varios factores. Por ejemplo, si el enriquecimiento plegado de secuencias deseadas o específicas es mayor en cada ronda, menos rondas serán suficientes. Sin embargo, si un ensayo permite una alta proporción de secuencias no deseadas en el grupo enlazado, se necesitarán rondas adicionales para enriquecer las secuencias de ARN deseadas. Una limitación de la técnica o una consecuencia no intencionada de la necesidad de ciclos adicionales de selección-amplificación que deben tenerse en cuenta es la posibilidad de que pueda introducir artefactos o enriquecer secuencias que tengan propiedades no relacionadas como sus capacidad de amplificar. Por último, mientras que algunas aplicaciones se benefician de los aglutinantes de mayor afinidad, para otros usos, se debe alcanzar un equilibrio durante el proceso de selección-amplificación entre la afinidad de enlace y la función porque las secuencias de enlace más estrictas podrían no ser necesariamente las secuencias más funcionales en contextos biológicos (por ejemplo, si una secuencia es reconocida varias veces por diferentes proteínas durante el empalme).

Entre las modificaciones y solución de problemas para mejorar el procedimiento, se puede emplear la selección negativa o la selección de contadores para aumentar la especificidad. Del mismo modo, el uso de diferentes protocolos de partición, como el ensayo de unión de filtros seguido por el ensayo de desplazamiento de movilidad de gel, puede eliminar el enriquecimiento de secuencias no deseadas que se unen, por ejemplo, al filtro de nitrocelulosa o a una matriz de columnas21. Dado que las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos tienen componentes específicos y no específicos, las condiciones de amortiguación, como la sal y el pH, tienen efectos sobre las interacciones ARN-proteína. Además, el uso de una concentración adecuada de proteínas puede tener un efecto directo en la retención de aglutinantes fuertes, débiles e inespecíficos. La presión de selección se puede aumentar en rondas sucesivas, por ejemplo, mediante la inclusión de un ARN competidor, la reducción de la concentración de proteínas o la reducción del tiempo de incubación. Por lo tanto, las consideraciones cuidadosas y la optimización de estos parámetros pueden afectar al resultado del protocolo SELEX.

Recientemente, se han desarrollado muchas variaciones o modificaciones del protocolo ORIGINAL SELEX que superan algunas de las limitaciones mencionadas anteriormente. Estos incluyen el alto rendimiento-SELEX (HT-SELEX), que combina SELEXy la secuenciación masivamente paralela 6, RNAcompete, que implica la incubación con exceso de ARN no aleatorio, extracción del ARN unido, etiquetado fluorescente de ARN, y análisis sobre microarrays5, RNA Bind-n-Seq, que combina el análisis de afinidad de ARN de forma cuantitativa y de alto rendimiento22,y RAPID-SELEX, que acorta el proceso e incluye un paso23de no amplificación.

Bases modificadas químicamente se han utilizado para ampliar el repertorio de las moléculas de ARN para aplicaciones específicas24. Diagnóstico, terapia, así como moléculas con actividades catalíticas se encuentran entre las muchas aplicaciones (incluyendo en la medicina) de las moléculas seleccionadas25. Los aptamers complementan los protocolos basados en anticuerpos y proporcionan excelentes herramientas cuyo potencial, por ejemplo, en diagnóstico, terapias y otras aplicaciones, sigue siendo plenamente explotado26,27,28. En el futuro, por ejemplo, los beneficios clínicos se encuentran entre las numerosas aplicaciones deseadas, más allá de lo que el primer aptámero aprobado por la FDA (Pegaptanib sódico) podría ofrecer para la degeneración macular relacionada con la edad. La tecnología proteómica escalable para mediciones de proteínas ofrece un paso hacia la comprensión de la salud y las enfermedades24.

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Disclosures

El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

El autor agradece a los Institutos Nacionales de Salud por la financiación pasada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
Glass Plates Standard Standard
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
polyacrylamide gel solutions Standard Standard
Proteinase K NEB P8107S
Recombinant PTB Laboratory Preparation Not applicable
Reverse Transcriptase NEB M0277S
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films Standard Standard

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References

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Genética Número 150 Proteína de unión al ARN amplificación de selección iterativa empalme sitio de polipirimidina-tracto/3'splice SELEX evolución de la secuencia en un tubo de ensayo
Explorar el espacio de secuencia para identificar sitios de unión para proteínas reguladoras que unen el ARN
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Singh, R. Exploring Sequence Space… More

Singh, R. Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59635, doi:10.3791/59635 (2019).

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