Summary
序列特异性对基因调控至关重要。识别特定序列的调控蛋白对基因调控非常重要。为这种蛋白质定义功能结合位点是一个具有挑战性的生物学问题。此处描述了一种用于识别RNA结合蛋白结合位点的迭代方法,适用于所有RNA结合蛋白。
Abstract
基因调节在所有细胞中起着重要的作用。转录、转录后(或RNA处理)、翻译和翻译后步骤用于调节特定基因。序列特异性核酸结合蛋白针对特定序列来控制空间或时间基因表达。核酸中的结合位点通常以突变分析为特征。然而,许多感兴趣的蛋白质没有已知的结合位点进行这种表征。在这里,我们描述了一种识别RNA结合蛋白以前未知的结合位点的方法。它涉及从随机序列池开始的序列的迭代选择和放大。经过几轮这些步骤的转录、绑定和扩增,富集序列被序列为识别首选的绑定位点。使用体外结合测定法对这种方法的成功进行监测。随后,体外和体内功能测定可用于评估所选序列的生物相关性。这种方法允许识别和表征任何RNA结合蛋白的先前未知的结合位点,而该蛋白存在分离蛋白质结合和未结合RNA的测定。
Introduction
在细胞生物学中,基因调控起着核心作用。在基因表达途径的一个或多个步骤中,基因具有被调节的潜力。这些步骤包括转录(启动、伸长和终止)以及拼接、多化或3'端形成、RNA导出、mRNA翻译和初级转录的衰变/定位。在这些步骤中,核酸结合蛋白调节基因调控。识别这种蛋白质的结合位点是研究基因控制的一个重要方面。突变分析和遗传序列比较已用于发现核酸中的调控序列或蛋白质结合位点,如启动子、拼接位点、聚化元素和转化信号1。2,3,4.
前mRNA拼接是基因表达和调控过程中不可或缺的一步。大多数哺乳动物的基因,包括人类的基因,都有内源基因。这些转录本的很大一部分是交替拼接的,从同一基因或主转录本产生多个mRNA和蛋白质异构体。这些等体在细胞生物学中具有细胞特异性和发育作用。5' 拼接位点、分支点和聚苯乙烯-3'拼接位点是受监管的关键拼接信号。在负调节中,否则强接头位被抑制,而在正调节中,否则弱拼接位点被激活。这些事件的组合会产生大量功能上不同的异形。RNA结合蛋白在这些替代拼接事件中起关键作用。
许多蛋白质是已知的,其结合位点或RNA靶点仍有待确定5,6。将调节蛋白与其下游生物靶点或序列联系起来通常是一个复杂的过程。对于此类蛋白质,识别其靶向RNA或结合位点是确定其生物功能的重要一步。一旦确定结合位点,可以使用标准的分子和生化分析进一步描述它。
此处描述的方法有两个优点。首先,它可以识别一个以前未知的结合位点,用于感兴趣的蛋白质。其次,这种方法的一个附加优势是,它同时允许饱和突变,否则,为了获得绑定站点中序列要求的可比信息,这将会是劳动密集型的。因此,它提供了一个更快,更容易,成本更低的工具,以确定RNA中的蛋白质结合位点。最初,这种方法(SELEX或通过易解体扩能对利坦的系统性进化)用于表征噬菌体T4DNA聚合酶(基因43蛋白)的结合位点,该结合位点与核糖体结合位点在其自己的mRNA中重叠。绑定站点包含一个 8 基循环序列,表示用于分析7的 65,536 个随机变体。其次,该方法还被独立用于表明,可以从大约10个13个序列8的池中选择不同染料的特定结合位点或贴合剂。事实上,这种方法已经在许多不同的环境中广泛使用,用于识别用于结合许多配体(如蛋白质、小分子和细胞)的贴合剂(RNA或DNA序列),以及催化9。例如,一个贴皮剂可以区分两种黄烷衍生物,咖啡因和茶碱,它们因咖啡因10中一个甲基组的存在而不同。我们广泛使用这种方法(SELEX或迭代选择-放大)来研究RNA结合蛋白在拼接或拼接调节11中的作用,这将是下面讨论的基础。
随机库:我们使用31个核苷酸的随机库。随机库的长度考虑松散地基于一种理念,即一般拼接因子 U2AF65绑定到分支点序列和 3' 拼接站点之间的序列。平均而言,元群中这些拼接信号之间的间距在20至40个核苷酸范围内。另一种蛋白质性致命已知结合一个不良特征的调节序列附近的3'拼接位,其目标前mRNA,变压器。因此,我们选择了31个核苷酸的随机区域,两侧是具有限制性酶位点的引物结合位点,以允许PCR扩增和附件T7RNA聚合酶启动子进行体外转录。理论库大小或复杂性为431或约1018。我们使用这个库的一小部分来准备我们的随机RNA池(#10 12-1015)用于下面描述的实验。
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Protocol
注:图1概述了迭代选择-放大(SELEX)过程中的关键步骤。
1. 生成随机库模板
- 合成前引物5'- GTAATACGACTACTATAGGGTGATCAATATCCA-3'和反向引物5'- GCGACGGATCCAGCTT CA-3',通过在DNA合成器上的化学合成。
注:引信和随机库可以进行商业合成。 - 合成随机库寡核苷酸模板 5'- GGTAtATATCTAtCTCTCTCTCTCTCTCTCCA(N1...N31)通过化学合成,TGAAGCTATGCGC-3'。在合成过程中,对上述31个随机位置(如N)使用四磷酰胺的模样混合物。
注: 库模板序列包含 31 个随机核苷酸(N1 到 N31)和侧翼序列,用于向前和反向引基进行结合。前进引物包括用于体外转录的T7 RNA聚合酶启动子序列(下划线)和用于克隆的限制性位点Bcl1(斜体)。反向引物含有限制性酶位点BamH1和HindIII(斜体),以促进克隆。
2. DNA随机库池的生成
- 通过聚合酶链反应 (PCR) 将 T7 RNA 聚合酶启动子连接到库中,其中包含 1 μM DNA 随机库模板、每个引物 1 μM、20 mM Tris(pH8.0)、1.5 mM MgCl 2、50 mM KCl、0.1 μg/μL 乙酸牛血清白蛋白、2 单位Taq_/c1+ 聚合酶和 200 μM dNTP(脱氧腺苷、脱氧腺苷、脱氧血氨酸和三磷酸氧氧乙酰胺)。
- 使用五个周期的变性、退火和延长步骤(94 °C 1 分钟,53°C 1 分钟,72 °C 1 分钟),然后是一个延长周期(72 °C 10 分钟)。
3. 池 0 RNA 的合成
- 设置100μL转录反应12。混合T7转录缓冲液,1 μM随机库池DNA,5 mM二硫磷酸醇(DTT),2 mM三磷酸二磷酸(GTP),1 mM每个三磷酸腺苷(ATP),三磷酸三磷酸球苷(CTP)和尿氨酸三磷酸(UTP),以及2个单位/μL T7RNA聚合酶。
注:RNA可在体外转录,使用市售试剂盒,可选有T7或SP6 RNA聚合酶。 - 在37°C下在微离心管中孵育上述反应混合物2小时。
- 凝胶在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中纯化RNA。
- 通过在转录反应中包括放射性痕迹(0.5 μL 或更少的β-32 P UTP),用亚甲蓝色或自径成像染色,确定凝胶上转录本的位置。
- 将凝胶片放入离心管中,然后切成小块,例如,用同质器尖端。添加蛋白酶 K (PK) 缓冲液 (100 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 12.5 mM EDTA, 1% 硫酸钠) 浸入凝胶片中。在室温下,将管子放在螺母上2小时至过夜。
- 在高速微离心机(14,000 rpm 或 16,873 x g)中旋转 5 分钟,在室温下清除凝胶碎屑并回收缓冲液。
- 用同等体积的苯酚氯仿和一次氯仿涡状样品两次。
- 将以上水相与十分之一体积的醋酸钠(3.0 M,pH 5.2)、10 μg tRNA 或 20 μg 糖原和乙醇(2~3卷,储存在-20°C) 混合。将管保持至 -80°C 1 小时。
- 在微离心机(14,000 rpm 或 16,873 x g) 中,在 4°C 下旋转含有溶液的管 5-10 分钟。小心丢弃上清液。用70%乙醇冲洗RNA颗粒,旋转2~5分钟。空气干燥RNA颗粒。
- 在用二乙酰热盐(DEPC)处理的50μL水中溶解RNA颗粒。将样品留在-20°C存放。
注:使用市售的旋转柱净化RNA,目前这些旋转柱更常用去除未结合的放射性,并作为RNA纯化的快速和更方便的替代品。
注意:使用丙烯酸玻璃护罩、手套和其他预防措施,以防止放射性。
4. 蛋白质结合反应和结合RNA的分离
- 在10mM Tris-HCl中进行蛋白质和RNA结合,pH 7.5体积为100μL,向这些最终浓度中加入以下成分:50 mM KCl,1 mM DTT,0.09 μg/μL牛血清白蛋白,0.5单位/μL RNasin,0.15 μg/μL tRNA,1 mM EDTA 和 30 μL 的适当重组蛋白 (PTB) 浓度。从适当的池中添加RNA。
注: 拼接因子 U2AF65通常绑定到模型内子的聚苯乙烯-tract/3' 拼接位点,其结合亲和力(平衡解离常数或Kd)约为 1–10 nM。因此,前两轮结合使用的蛋白质浓度比K d为U2AF65高10倍;对于SXL和PTB蛋白,这个范围内的起始浓度只是我们最好的猜测。这确保了所需的RNA物种可以结合,虽然较低的亲和序列也有可能结合。在第3轮和第4轮(转录、结合和扩增)中,蛋白质浓度降低了三倍(步骤4.1)。这样做是为了连续消除低亲和力RNA物种。 - 将含有结合反应的管子在25°C下置于温度块(或冰上)约30分钟。
- 使用以下步骤,在前 4 轮选择扩增中,从未结合的 RNA 中对结合RNA 进行分馏。
- 在室温下通过连接到真空歧管的硝化纤维素过滤器过滤样品(100 μL)。
注:RNA-蛋白复合物(但不是未结合的RNA)仍留在过滤器上。 - 用无菌剃刀刀片将带有保留的RNA的过滤器切成碎片;将它们插入离心管中。将过滤器片段浸入蛋白酶 K (PK) 缓冲液中,轻轻翻滚管至少 3 小时(或过夜),以恢复 RNA。
- 在苯酚氯仿(1:1)和氯仿等体积下涡旋RNA样品,使其脱蛋白。每次通过在室温下高速离心样品5分钟来恢复水相。
- 与醋酸钠(0.1体积3.0 M,pH 5.2)和乙醇(2~3卷绝对乙醇,200证明)混合。将管子放入-80°C冷冻室30分钟,高速离心10分钟,然后按照洗涤和干燥步骤(步骤3.8),在DEPC处理的水中溶解RNA。这些步骤概述在上面(步骤 3.6 到 3.9)。
- 在室温下通过连接到真空歧管的硝化纤维素过滤器过滤样品(100 μL)。
- 将蛋白质结合的RNA分数从最近2轮(第5轮和第6轮;转录、结合和扩增)的未结合分数中分离出来,如下所示。将结合反应(步骤 4.1)中的蛋白质浓度进一步降低三倍,以增加选择压力,以丰富高亲和力结合序列并优先去除低亲和力序列。
- 在设置上述RNA:蛋白结合(步骤4.1)反应之前,在0.5xTBE缓冲液(Tris-Borate-EDTA)中预铸原生聚丙烯酰胺凝胶(5%,60:1丙烯酰胺:乙酰胺比)。在冷室(4°C)中电液,应用250 V15分钟。
- 将上述RNA:蛋白结合反应(步骤4.1)移入该凝胶的不同井中。
注:该蛋白质储存在-80°C,在使用前稀释在20mM 4-(2-Hydroxyhyl)管电-1-乙酸乙酸(HEPES),pH 8.0,20%甘油,0.2m二甲二甲酸酯酸(EDTA),0.05%NP-40和1mM二硫乙醇(Dthiothiitol)。添加 0.5~1.0 mM 蛋白酶抑制剂苯基甲烷硫酸盐 (PMSF) 是可选的。在结合反应中,该缓冲液可贡献约6%的甘油,允许将样品直接装载到井中,而无需将其与单独的凝胶加载缓冲液混合。 - 在250 V的冷室(4°C)使用凝胶电泳从未结合的RNA中分馏结合RNA,1至2小时。这个过程也被称为凝胶移动转移测定。
注:电泳的持续时间因RNA和用于结合的蛋白质的特性而异。 - 将凝胶暴露在X射线膜中,并使用自辐射法识别结合RNA的位置。用结合的RNA切出凝胶片,并将其插入管中。
- 在PK缓冲液中孵育粉碎的凝胶切片,用于洗脱3小时或过夜。
- 重复上述步骤 3.5 至 3.9。简单地说,涡旋洗脱的RNA样品首先用苯酚氯仿,然后用氯仿。
- 氯仿提取后,将醋酸钠和乙醇与水相混合。在-80°C冷冻箱中孵育后,在4°C下旋转5-10分钟,收集RNA颗粒。用乙醇清洗RNA颗粒,通过打开管盖将其晾干。将RNA溶解在用DEPC处理的水中。
注: 切换到凝胶流动性转移分析进行分馏,可以消除可能富集用于结合的不需要的RNA物种,例如,此处与基硝基纤维素过滤器(或任何基质)用于分馏的初始轮数。
5. 逆转录和PCR扩增
- 使用逆转录酶和反向引基从溶解RNA合成cDNA,在42°C下孵育20μL反应(2μL的10xRT缓冲液,2μL的AMV逆转录酶,1μM反向引基,10μL的RNA,可选的RN酶抑制剂)在42°C下孵育60分钟。
- 如步骤 2.1 所述,使用 20-25 PCR 周期放大 cDNA。
6. 转录和蛋白质结合
- 重复RNA合成、蛋白质结合、蛋白质结合分离和未结合分数的分离过程,如上文第3~5节所述。
7. RNA-蛋白质相互作用分析
- 使用凝胶移动移位测定(步骤 4.4)或过滤器结合测定(步骤 4.3)来确定选定池或每个池内单个序列的绑定相关性和特异性(参见步骤 8.3)。
- 使用自辐射成像或荧光粉成像仪检测和量化结合分数和未绑定分数中的波段。
8. 克隆和测序
- 用限制性酶Bcl1和HindIII消化最终PCRDNA产物1⁄2小时,用适当消化的pGEM3或其他带限制部位的质粒从2小时到一夜之间,将结扎产物转化为合格的细菌细胞通过热冲击或电穿孔使用标准分子生物学程序13。
- 在37°C下用Luria-Bertani(LB)介质和阿霉素(50微克/mL)在琼层藻板上电镀转化的细胞,一夜之间滋生细菌。挑选菌落,为含有LB液体介质的培养管接种,并生长在37°C的摇动培养箱过夜。使用标准质粒分离方案13纯化含有DNA插入物的质粒DNA。
注:商用试剂盒可用于质粒纯化。 - 按照制造商的测序说明14,使用DNA插入物对质粒进行测序。
注:测序可以在内部执行,也可以进行商业化。
9. 序列对齐
- 使用可用的在线对齐工具对齐序列并获得共识绑定站点
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)。
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Representative Results
以下观察结果表明选择放大(SELEX)是成功的。首先,我们分析了池0和选定的序列,以便与用于迭代选择-扩增方法的蛋白质结合。图2显示,哺乳动物聚丙胺-结合蛋白(PTB)几乎不能检测到结合到池0序列,但与所选序列池的亲和力较高。当我们使用比所选池相比,蛋白质浓度高出约 300 倍时,几乎无法检测到对池 0 的结合。因此,随机池或起始池与所选池之间的蛋白质结合亲和力至少相差几百倍。该观测实验证实,此处所述的选择放大方案是成功的。
其次,我们对所选池进行排序,并确定共识绑定站点。从哺乳动物PTB选择的池中大多数选定序列的对齐中获得的共识序列是:GCCUG(Y/G)UGYYYYYYYYYG(Y/G)CCC。这表明,我们已经选择了独特的富丙胺序列,结合PTB11。当我们对果蝇PTB的RNA结合域进行迭代选择扩增时,我们丰富了被瓜诺辛中断的CU富序列。在果蝇PTB选择的高亲和力序列中,有84%的富含紫杉酯的序列:GCUUUCCUCUCCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCUCU事实上,这个序列类似于α-特罗莫霉素内创中存在的富丙胺序列,它与哺乳动物PTB15结合,受调节。我们已经成功地多次使用这种方法来研究RNA结合的特性和功能拼接调节器和拼接因子11,15,16。表1显示了利用SELEX识别其首选或共识结合位点的RNA结合蛋白的成功示例。
第三,基于替代3'拼接位点选择的体外拼接测定,显示了不同但重叠的RNA结合结合蛋白的功能相关性。默认情况下使用上游 3' 拼接站点,而添加重组 PTB 会导致备用或下游 3' 拼接站点的激活(图 3)。相反,添加重组hnRNP C17会导致抑制两个3'拼接位点。增加重组一般拼接因子 U2AF65可反转 hnRNP C1 介导的 3' 拼接位点抑制(图3)以及 PTB 介导效应对下游 3' 拼接站点激活(未显示数据)。对这些效应的简单解释是一般拼接因子 U2AF65和 PTB(也称为 hnRNP I)之间的绑定直接竞争,后者优先绑定并抑制某些 3' 拼接位点,或 U2AF65和hnRNP C,它绑定并抑制两个 3' 拼接位点。
图 1:迭代选择-放大过程 (SELEX) 中关键步骤的摘要。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:富集PTB结合RNA。重组PTB的浓度增加(填充三角形)用于放射性标记池0RNA或经过六轮选择和扩增后获得的选定池。指示未结合的RNA和RNA:蛋白质复合物的位置。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:Splice站点开关测定验证了苯丙胺结合蛋白的不同结合特性。(A- 顶部)拼接基板的原理图。拼接基板包含一个 5' 拼接位点和两个替代 3' 拼接点,位于内创子两侧。矩形(开放、水平线和实体)是外向子,线是内龙。(A-底部) hnRNP C1 抑制上游 3' 拼接位点(不激活下游 3' 拼接位点),而 PTB 导致下游 3' 拼接站点的激活。拼接基质在HeLa细胞核提取物中孵育。使用带拼接结底漆(箭头)的引体延伸测定18对拼接产物(两侧所示)进行分析,该底漆可识别公共5'拼接位点到上游或下游3'拼接位点。(B) 重组 U2AF65 (rU2AF65) 扭转了 hnRNP C1 的压制作用.在拼接反应中添加重组的hnRNP C1、PTB或rU2AF65蛋白由 + 符号指示。请点击此处查看此图的较大版本。
| 蛋白 | 首选序列 |
| U2AF65 | 包含 Cs 的 U-富 |
| SXL | U-富,含2-4Gs |
| Ptb | UCUUC 富于一些 Gs |
| hnRNP C1 | U-富(5-6 长) |
| CstF64 | 富贵 |
| hnRNP E1/E2 和 K | C-富 |
| U2AF65/U2AF35异物 | 乌乌尤尤努古 |
表1:某些RNA结合蛋白的首选结合位点。
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Discussion
核酸结合蛋白是动植物发育的重要调节剂。SELEX 程序的一个关键要求是开发可用于分离蛋白质结合和未结合的 RNA 馏分的测定。原则上,此测定可以是体外结合测定,如滤芯结合测定、凝胶移动转移测定或重组蛋白、纯化蛋白或蛋白质复合物的基质结合测定19。测定也可以是酶测定,其中前体和产品(或中间体)可以根据大小或其他某种方式分离20。
虽然诱变被广泛用于表征蛋白质结合位点,但它既费时又耗时,而且序列较长,不易适应饱和突变。此处描述的迭代绑定和放大方法的意义是,它不仅克服了上述一些限制,而且最重要的是可以识别以前未知的绑定站点,并提供有关同时对每个位置的核苷酸要求。
迭代选择扩增成功的一个重要考虑因素是结合亲和力和特异性。通常,使用12至15轮选择扩增,并定期对10个12至10个15个分子的序列空间进行采样。选择放大协议的进展和最终成功可以通过结合测定或直接测序来监测,该测序分别监测中间池中特定序列的亲和力或富集。虽然结合测定是传统上使用的,但下一代测序的出现使得通过手动Sanger测序14无法以不可能的方式分析序列富集。
SELEX 成功的一个关键步骤是在每个步骤中折叠富集所需的分子。SELEX 所需的周期数各不相同,具体取决于几个因素。例如,如果每轮所需序列或特定序列的折叠富集较高,则较少的圆就够了。然而,如果测定允许在绑定池中大量不需要的序列,则需要额外的圆来丰富所需的RNA序列。技术的限制或需要额外的选择-放大周期的意外后果,必须记住,它有可能引入人工制品或丰富具有不相关属性的序列,例如其放大能力。最后,虽然有些应用程序受益于最高的关联绑定,但对于其他用途,在约束相关性和函数之间的选择放大过程中必须取得平衡,因为最紧密的绑定序列不一定是生物环境中功能最丰富的序列(例如,如果序列在拼接过程中被不同蛋白质多次识别)。
在改进程序的修改和故障排除中,可以使用负选择或计数器选择来增加特异性。同样,使用不同的分区协议,如过滤器结合测定后跟凝胶移动转移测定,可以消除不需要的序列的富集,例如,结合到硝基纤维素过滤器或列矩阵21。鉴于蛋白质-核酸相互作用具有特定和非特异性成分,缓冲条件(如盐和pH)对RNA-蛋白质相互作用有影响。此外,使用适当的蛋白质浓度可直接影响强、弱和非特异性粘合剂的保留。选择压力可以在连续轮次增加,例如,通过包括竞争对手的RNA,降低蛋白质浓度,或减少孵育时间。因此,仔细的考虑和优化这些参数可能会影响 SELEX 协议的结果。
最近,对原始 SELEX 协议进行了许多更改或修改,克服了上述一些限制。其中包括高通量-SELEX(HT-SELEX),它结合了SELEX和大规模平行测序6,RNA竞争,涉及与多量非随机RNA的孵育,下拉结合RNA,RNA的荧光标记,并分析微阵列5,RNA Bind-n-Seq,它结合了RNA亲和分析在定量和高通量的方式22,和RAPID-SELEX,这缩短了过程,包括非扩增步骤23。
化学修饰碱基已用于扩大RNA分子的特性,用于特定应用24。诊断,治疗,以及具有催化活性的分子是所选分子25的许多应用(包括医学)。Aptamers补充基于抗体的协议,并提供优秀的工具,其潜力,例如,在诊断,治疗和其他应用,仍有待充分利用26,27,28。例如,在未来,临床益处是众多所需应用之一,超出了第一个FDA批准的贴皮器(Pegaptanib钠)可以为与年龄相关的黄斑变性提供的应用。用于蛋白质测量的可扩展蛋白质组学技术为了解健康和疾病提供了一步。
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Disclosures
提交人宣布,他没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢国家卫生研究院过去的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
