Summary
Sekvens specificitet är kritisk för genreglering. Reglerande proteiner som erkänner specifika sekvenser är viktiga för genreglering. Att definiera funktionella bindnings platser för sådana proteiner är ett utmanande biologiskt problem. En iterativ metod för identifiering av en bindnings plats för ett RNA-bindande protein beskrivs här och gäller för alla RNA-bindande proteiner.
Abstract
Gen regleringen spelar en viktig roll i alla celler. Transkriptionella, post-transkriptionella (eller RNA-bearbetning), translationella och posttranslationella steg används för att reglera specifika gener. Sekvens-specifika nukleinsyra-bindande proteiner rikta specifika sekvenser för att kontrollera rumsliga eller temporala genuttryck. Bindnings platserna i nukleinsyror kännetecknas typiskt av mutationell analys. Många proteiner av intresse har dock ingen känd bindnings plats för sådan karakterisering. Här beskriver vi en metod för att identifiera tidigare okända bindnings platser för RNA-bindande proteiner. Det innebär iterativt urval och amplifiering av sekvenser som börjar med en randomiserad sekvens pool. Efter flera omgångar av dessa steg-transkription, bindning och förstärkning-den berikade sekvenser är sekvenserade för att identifiera en önskad bindnings plats (er). Framgången med denna metod övervakas med hjälp av in vitro-bindande analyser. Därefter kan funktionella analyser in vitro och in vivo användas för att bedöma den biologiska relevansen för de valda sekvenserna. Detta tillvägagångssätt möjliggör identifiering och karakterisering av en tidigare okänd bindnings plats (er) för något RNA-bindande protein för vilket ett test för att separera proteinbundna och obundna RNAs finns.
Introduction
I cellbiologi spelar gen regleringen en central roll. Vid ett eller flera steg längs gen uttrycks vägen har gener potential att regleras. Dessa steg inkluderar transkription (initiering, förlängning, och uppsägning) samt skarvning, polyadenylering eller 3 ' formation, RNA-export, mRNA översättning, och förfall/lokalisering av primära utskrifter. Vid dessa steg, nukleinsyra-bindande proteiner modulera genreglering. Identifiering av bindningsställen för sådana proteiner är en viktig aspekt av att studera gen kontroll. Mutational analys och fylogenetiska sekvens jämförelse har använts för att upptäcka regulatoriska sekvenser eller proteinbindnings ställen i nukleinsyror, såsom initiativtagare, skarvar platser, polyadenylation element, och translationella signaler1, 2 , 3 , 4.
Pre-mRNA splitsning är ett integrerat steg under genuttryck och reglering. Majoriteten av däggdjurs gener, inklusive de hos människor, har introner. En stor del av dessa utskrifter är alternativt splitsade och producerar flera mRNA-och proteinisoformer från samma gen eller primära avskrift. Dessa isoformer har cellspecifika och utvecklingsmässiga roller i cellbiologi. Den 5 ' splice plats, gren-punkt, och polypyrimidine-tarmkanalen/3 ' skarvning plats är kritiska skarvar signaler som är föremål för reglering. I negativ reglering, en annars stark skarvar plats är förtryckta, medan i positiv reglering en annars svag skarvar webbplats aktiveras. En kombination av dessa händelser ger en uppsjö av funktionellt distinkta isoformer. RNA-bindande proteiner spelar viktiga roller i dessa alternativa splitsnings händelser.
Många proteiner är kända vars bindnings plats (er) eller RNA-mål återstår att identifiera5,6. Att koppla reglerande proteiner till deras efterföljande biologiska mål eller sekvenser är ofta en komplicerad process. För sådana proteiner är identifieringen av deras målrna eller bindningsställe ett viktigt steg för att definiera deras biologiska funktioner. När en bindnings plats har identifierats kan den karaktäriseras ytterligare med hjälp av standardiserade molekylära och biokemiska analyser.
Den metod som beskrivs här har två fördelar. För det första kan den identifiera en tidigare okänd bindnings plats för ett protein av intresse. För det andra, en extra fördel med detta tillvägagångssätt är att det samtidigt tillåter mättnad mutagenes, som annars skulle vara arbetsintensiva att få jämförbar information om sekvens krav inom bindningsstället. Sålunda, den erbjudande en hurtigare, lättare, och mindre kostbar redskap till identifiera proteinet bindningsställen i RNA. Ursprungligen, detta tillvägagångssätt (Selex eller systematisk utveckling av ligander genom exponentiell berikning) användes för att karakterisera bindningsstället för bakteriofage T4 DNA polymeras (Gene 43 protein), som överlappar med ribosom bindningsstället i sin egen mRNA. Bindnings platsen innehåller en 8-bas loop-sekvens som representerar 65 536 randomiserade varianter för analys7. För det andra användes tillvägagångssättet också självständigt för att visa att specifika bindningsställen eller aptamers för olika färgämnen kan väljas från en pool med cirka 1013 sekvenser8. I själva verket har detta tillvägagångssätt i stor utsträckning använts i många olika sammanhang för att identifiera aptamers (RNA eller DNA-sekvenser) för bindande många ligander, såsom proteiner, små molekyler, och celler, och för katalys9. Som ett exempel, en aptamer kan diskriminera mellan två xantinderivat derivat, koffein och teofyllin, som skiljer sig genom närvaron av en metylgrupp i koffein10. Vi har i stor utsträckning använt denna metod (SELEX eller iterativ urval-amplifiering) för att studera hur RNA-bindande proteiner fungerar i splitsning eller splitsning regel11, som kommer att vara grunden för diskussionen nedan.
Det slumpmässiga biblioteket: vi använde ett slumpmässigt bibliotek med 31 nukleotider. Längden övervägande för det slumpmässiga biblioteket var löst baserat på tanken att den allmänna skarvning faktor U2AF65 binder till en sekvens mellan gren-punkt sekvens och 3 ' splice plats. I genomsnitt, avståndet mellan dessa skarvning signaler i metazoer är i intervallet 20 till 40 nukleotider. Ett annat protein kön-dödliga var känd för att binda till en dåligt karaktäriserad reglerande sekvens nära 3 ' skarvar plats för sitt mål pre-mRNA, transformator. Således valde vi en slumpmässig region av 31 nukleotider, flankerad av primer bindningsställen med restriktioner enzym platser för att möjliggöra PCR amplifiering och fastsättning av T7 RNA polymeras promotor för in vitro-transkription. Den teoretiska biblioteks storleken eller komplexiteten var 431 eller cirka 1018. Vi använde en liten del av detta bibliotek för att förbereda vår slumpmässiga RNA-pool (~ 1012-1015) för de experiment som beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anm.: i figur 1 finns en sammanfattning av de viktigaste stegen i processen för iterativ val-amplifiering (Selex).
1. generering av en slumpmässig Biblioteksmall
- Syntetisera framåt primer 5 '- Gtaatacgactcactatagggtgatcagattctgatcca-3 ' och omvänd primer 5 '-GcgacGgatccaagcttca-3 ' genom kemisk syntes på en DNA-synt.
Anmärkning: primers och slumpmässiga bibliotek kan syntetiseras kommersiellt. - Syntetisera ett slumpmässigt bibliotek oligonukleotide mall 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) tgaagcttggatccgtcgc-3 ' genom kemisk syntes. Använd en ekvimolära blandning av fyra fosforamiditer under syntesen för de 31 randomiserade positioner som visas ovan som N.
Obs: sekvensen av biblioteks mal len innehåller 31 slumpmässiga nukleotider (N1 till N31) och kompletterande sekvenser för bindning av framåt och bakåt primers. Den framåtriktade primern inkluderar T7 RNA polymeras promotionssekvensen (understruken) för in vitro-transkription och en begränsnings plats Bcl1 (kursiv) för kloning. Den omvända primer innehåller restriktioner enzym platser BamH1 och hindiii (kursiv) för att underlätta kloning.
2. generering av DNA slumpmässig bibliotekspool
- Fäst T7 RNA polymeras promotorn till biblioteket genom polymeras kedjereaktion (PCR) som innehåller 1 μm DNA slumpmässig Biblioteksmall, 1 μm av varje primer, 20 mm tris (pH 8,0), 1,5 mm mgcl2, 50 mm KCL, 0,1 μg/μl Acetylerat bovint serumalbumin, 2 enheter av Taq < /C1 > polymeras och 200 μM vardera av dNTPs (deoxyguanosin, deoxyadenosin, deoxycytidin och deoxythymidine trifosfat).
- Använd fem cykler av denaturering, glödgning och förlängnings steg (94 ° c i 1 min, 53 ° c i 1 min och 72 ° c i 1 min) av PCR följt av en förlängnings cykel (72 ° c i 10 min).
3. syntes av pool 0 RNA
- Ställ in en 100 μL transkriptionsreaktion12. Mix T7 transkription buffert, 1 μm slumpmässigt bibliotek pool DNA, 5 mm Ditiotreitol (dTT), 2 mm Guanosintrifosfat (GTP), 1 mm vardera av adenosintrifosfat (ATP), cytidin trifosfat (CTP), och uridin trifosfat (UTP), och 2 enheter/μl T7 RNA-polymeras
Anmärkning: RNA kan transkriberas in vitro med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit med en option på T7 eller SP6 RNA-polymeras. - Inkubera ovanstående reaktionsblandning i ett microcentrifugerör för 2 h vid 37 ° c.
- Gel renar RNA i en 10% denaturerande polyakrylamidgel.
- Identifiera placeringen av avskrifter på gelen genom att infärgning den med metylenblått eller autoradiografi genom att inkludera spår av radioaktivitet (0,5 μL eller mindre av α-32P UTP) i transkriptionsreaktionen.
- Placera gel slice i ett centrifugrör och Bryt i mindre bitar, till exempel, med en homogenisator spets. Tillsätt proteinas K (PK) buffert (100 mm Tris, pH 7,5, 150 mm NaCl, 12,5 mm EDTA, 1% natriumdodecylsulfat) att doppa gel bitarna. Lämna röret på en nutator från 2 h till natten vid rumstemperatur.
- Snurra i en mikrocentrifug med hög hastighet (14 000 rpm eller 16 873 x g) i 5 minuter vid rumstemperatur för att ta bort gel-skräpet och återvinna buffertlösningen.
- Virvel provet två gånger med en lika stor mängd fenol-kloroform och en gång med kloroform.
- Blanda vattenfasen ovanifrån med en tiondels volym natriumacetat (3,0 M, pH 5,2), 10 μg tRNA eller 20 μg glykogen och etanol (2 – 3 volymer, lagrat vid-20 ° c). Lämna rören vid-80 ° c i 1 h.
- Snurra rören som innehåller lösningen i 5 – 10 minuter vid 4 ° c i en mikrocentrifug (14 000 rpm eller 16 873 x g). Kassera supernatanten noggrant. Skölj RNA-pelleten med 70% etanol och snurra i 2 – 5 min. Aspirera etanol noggrant. Lufttorka RNA-pelleten.
- Solubilisera RNA-pelleten i 50 μL vatten som behandlats med dietylenpyrokarbonat (DEPC). Lämna provet vid-20 ° c för förvaring.
Anmärkning: rena RNA med hjälp av kommersiellt tillgängliga spinn pelare, som för närvarande används oftare för att avlägsna oinkorporerade radioaktivitet och fungera som ett snabbt och bekvämare alternativ för RNA-rening.
FÖRSIKTIGHET: Använd en akrylglas sköld, handskar, och andra försiktighetsåtgärder för att skydda mot radioaktivitet.
4. proteinbindnings reaktion och separation av bundet RNA
- Utför bindning av protein och RNA i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i en volym av 100 μL genom tillsats av följande ingredienser till dessa slutliga koncentrationer: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μL bovint serumalbumin, 0,5 enheter/μL RNasin, 0,15 μg/μL tRNA , 1 mM EDTA och 30 μL lämplig rekombinant protein (PTB) koncentration. Lägg till RNA från lämplig pool.
Anmärkning: skarvfaktorn U2AF65 binder typiskt till polypyrimidin-tarmkanalen/3 ' skarvar av modell introner med en bindningsaffinitet (jämvikts dissociationskonstant eller Kd) på cirka 1 – 10 nm. Därför, de två första omgångarna av bindande används proteinkoncentration 10-faldig över Kd för U2AF65; för SXL-och PTB-proteiner var startkoncentrationen i detta intervall bara vår bästa gissning. Detta säkerställde att önskad RNA-art som kunde binda, även om lägre affinitetssekvenser också potentiellt destinerade. I omgångar 3 och 4 (transkription, bindning och amplifiering) reducerades protein koncentrationen tre gånger (steg 4,1). Detta gjordes för att successivt eliminera låg affinitet RNA arter. - Placera rören som innehåller de bindande reaktionerna i ca 30 min vid 25 ° c i ett temperatur block (eller på is).
- Fraktionera det bundna RNA från det obundna RNA för de första 4 rundorna av urvals-amplifiering med hjälp av följande steg.
- Filtrera provet (100 μL) vid rumstemperatur genom ett nitrocellulosafilter monterat på ett vakuumrör.
Anmärkning: RNA-proteinkomplexet, men inte det obundna RNA, finns kvar på filtret. - Hacka filtret med behållna RNA i fragment med en steril rakblad; sätt in dessa i ett centrifugerör. Återhämta RNA genom att tumla röret försiktigt i minst 3 h (eller över natten) med filter bitar nedsänkt i proteinas K (PK) buffert.
- Deproteinize RNA provet genom att vortexa det i närvaro av en lika stor volym fenol-kloroform (1:1) och sedan av kloroform. Återvinner vattenfasen varje gång genom att centrifugering provet i hög hastighet i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Blanda med natriumacetat (0,1 volym 3,0 M, pH 5,2) och etanol (2 – 3 volymer av absolut etanol, 200 bevis). Lämna röret i en-80 ° c frys i 30 min, Centrifugera den med hög hastighet i 10 min, och efter tvätt och torkning steg (steg 3,8), solubilize RNA i vatten som behandlats med DEPC. Dessa steg beskrivs ovan (steg 3,6 till 3,9).
- Filtrera provet (100 μL) vid rumstemperatur genom ett nitrocellulosafilter monterat på ett vakuumrör.
- Separera de proteinbundna RNA-fraktionerna från de obundna fraktionerna under de senaste 2 rundorna (avrundar 5 och 6; transkription, bindning och amplifiering) enligt följande. Minska protein koncentrationen i bindnings reaktionen (steg 4,1) med ytterligare trefaldigt för ytterligare markerings tryck för att berika bindnings sekvenser med hög affinitet och ta bort sekvenser med låg affinitet.
- Pre-Cast en infödd polyakrylamid gel (5% med 60:1 akrylamid: BIS-akrylamid ratio) i 0,5 x TBE buffert (Tris-borate-EDTA) före inrättandet av ovanstående RNA: protein bindning (steg 4,1) reaktion. Electrophorese denna gel i ett kallt rum (4 ° c) genom att tillämpa 250 V för 15 min.
- Pipettera över RNA: proteinbindande reaktioner (steg 4,1) i olika brunnar i denna gel.
Anmärkning: proteinet lagras vid-80 ° c och spädas före användning i 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-etanesulfonic syra (HEPES), pH 8,0, 20% glycerol, 0,2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,05% NP-40 och 1 mM ditiothreitol (DTT). Tillsats av 0,5 – 1,0 mM proteashämmare fenylmetan sulfonylfluorid (PMSF) är frivilligt. I den bindande reaktionen bidrar denna buffert till ca 6% glycerol, vilket möjliggör direkt lastning av proverna i brunnarna utan att man behöver blanda dem med en separat gel-lastningsbuffert. - Fraktionera det bundna RNA från det obundna RNA med hjälp av gelelektrofores i ett kallt rum (4 ° c) vid 250 V för 1 till 2 h. Denna process är också känd som gel Mobility Shift assay.
Obs: varaktigheten av elektrofores varierar beroende på egenskaper hos RNA och protein som används för bindning. - Exponera gelen till en röntgenfilm och identifiera placeringen av det bundna RNA med Autoradiography. Klipp ut gel skiva med bundet RNA och sätt in den i ett rör.
- Inkubera den krossade gelbiten i den PK-buffert som används för eluering under 3 timmar eller över natten.
- Upprepa steg 3,5 till 3,9 som beskrivs ovan. Kort, Vortex den eluerade RNA provet kraftigt först med fenol-kloroform och sedan med kloroform.
- Blanda natriumacetat och etanol med vattenfasen efter kloroformextraktion. Efter inkubering i-80 ° c frys, snurra vid 4 ° c i 5 – 10 min för att samla upp RNA-pelleten. Tvätta RNA-pelleten med etanol och lufttorka den genom att lämna locket på röret öppet. Lös RNA i vatten som behandlats med DEPC.
Anmärkning: byte till gel Mobility Shift-analysen för fraktionering medger eliminering av oönskade RNA-arter som kan ha berikats för bindning, till exempel till nitrocellulosa-filtret här (eller någon matris) som används i de initiala omgångarna för fraktionering.
5. omvänd Transkription och PCR-amplifiering
- Syntetisera cDNA från det upplösta RNA med omvänd transkriptas och omvänd primer genom att ruinera 20 μL-reaktionen (2 μL 10X RT-buffert, 2 μL AMV omvänt transkriptas, 1 μM omvänd primer, 10 μL RNA, RNase-hämmare tillval) vid 42 ° c i 60 min.
- Amplifiera cDNA med 20 – 25 PCR-cykler enligt beskrivningen i steg 2,1.
6. transkription och proteinbindning
- Upprepa processen för RNA-syntes, proteinbindning, separation av proteinbunden och obunden fraktion, som beskrivs i avsnitt 3 – 5 ovan.
7. analys av RNA-proteininteraktioner
- Använd gel Mobility Shift-analysen (steg 4,4) eller filterbindningsanalysen (steg 4,3) för att bestämma bindningstillhörighet och specificitet för valda pooler eller enskilda sekvenser inom varje pool (se steg 8,3).
- Använd autoradiografi eller en fosfor kamera för att detektera och kvantifiera band i den bundna fraktionen och obundna fraktionen.
8. kloning och sekvensering
- Smälta den slutliga PCR-DNA-produkten med restriktionsenzymer Bcl1 och HindIII för 1 – 2 h, Ligat med lämpligt smält pGEM3 eller andra plasmider som transporterar begränsnings platserna från 2 h till över natten, omvandla ligeringsprodukten till kompetenta bakterieceller genom värme chock eller elektroporation med hjälp av standardiserade molekylbiologiska procedurer13.
- Odla bakterier över natten genom att plätering de transformerade cellerna på agar plattor med Luria-Bertani (LB) medium och ampicillin (50 μg/mL) vid 37 ° c. Välj kolonier för att Inokulera odlings rör som innehåller LB flytande medium med ampicillin och växa vid 37 ° c i en skakande inkubator över natten. Renar plasmid DNAs som innehåller DNA-skär med hjälp av ett standardiserat plasmid-isolerings protokoll13.
Obs: kommersiella kit finns för plasmid rening. - Sekvensera plasmiderna med DNA-skär med sekvenserings protokollet dideoxy Chain terminering, enligt tillverkarens anvisningar för ordningsföljd14.
Observera: sekvensering kan utföras i hus eller göras kommersiellt.
9. sekvens justering
- Justera sekvenser och få en konsensus bindnings plats (er) med tillgängliga verktyg för justering online
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande observationer visar en lyckad urvals förstärkning (SELEX). Först analyserade vi pool 0 och de valda sekvenserna för bindning till det protein som används för det iterativa urvals-amplifieringsmetoden. Figur 2 visar att däggdjurs polypyrimidinbindande protein (PTB) visar knappt detekterbar bindning till pool 0-sekvensen men hög affinitet för den valda sekvenspoolen. Det var knappt detekterbar bindning till pool 0 när vi använde ca 300-faldig högre proteinkoncentration för bindning än används för den valda poolen. Således fanns det åtminstone en flera hundra gånger skillnad i proteinbindnings tillhörighet mellan slumpmässig eller starta pool och den valda poolen. Denna observation bekräftar experimentellt att urvals-amplifiering protokollet som beskrivs här är framgångsrik.
För det andra, vi sekvenserade den valda poolen och fastställt en konsensus bindande webbplats. Konsensus sekvensen erhålls från anpassningen av de flesta utvalda sekvenser från däggdjurs PTB-valda poolen var: GCCUG (Y/G) UGCYYYYCYYYG (Y/G) CCC. Detta visar att vi har valt unika pyrimidinrika sekvenser som binder PTB11. När vi utförde iterativt urval-förstärkning för RNA-bindande domän av Drosophila PTB, BERIKADE vi cu-rika sekvenser avbryts av guanosines. Bland de höga affinitet sekvenser som Drosophila PTB valt var en 84% pyrimidin-Rich sekvens: GCUUUCCUCUGUCGCCCUUCUUCGUCCCCUG. I själva verket, denna sekvens liknar den pyrimidin-rika sekvens som finns i alfa-Tropomyosin intron som binder med hög affinitet till och regleras av däggdjurs PTB15. Vi har framgångsrikt använt denna metod upprepade gånger för att studera RNA-bindande egenskaper och funktioner skarvning regulatorer och en skarvning faktor11,15,16. Tabell 1 visar framgångsrika exempel på RNA-bindande proteiner för vilka Selex användes för att identifiera deras föredragna eller kon sen SUS bindnings plats (er).
För det tredje, en in vitro-skarvning assay, som bygger på alternativ 3 "splice platsval, visar funktionell relevans av distinkta men överlappande RNA-bindande särdrag polypyrimidin-tarmkanalen bindande proteiner. En uppströms 3 ' splice plats används som standard, tillägg av rekombinant PTB leder till aktivering av alternativa eller nedströms 3 ' splice plats (figur 3). Däremot, tillsats av rekombinant hnRNP C17 leder till förtryck av båda 3 ' skarvar platser. Tillsats av den rekombinanta allmänna skarvfaktorn U2AF65 reverserar den hnRNP C1-medierade 3 ' skarvning plats förtryck (figur 3) samt PTB-medierad effekt på nedströms 3 ' splice webbplats aktivering (data som inte visas). En enkel förklaring till dessa effekter är en direkt konkurrens mellan bindningen av den allmänna splice faktor U2AF65 och PTB (även kallad hnRNP I), som företrädesvis binder till och pressar vissa 3 ' skarvar platser, eller mellan U2AF65 och hnRNP C, som binder till och pressar både 3 ' splice platser.
Figur 1: Sammanfattning av viktiga steg i iterativ urvals-amplifiering process (SELEX). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: anrikning av PTB-bindande RNAs. Ökande koncentration (fyllda trianglar) av rekombinant PTB användes med antingen radioaktivt märkt pool 0 RNA eller den valda poolen erhålls efter sex omgångar av urval och amplifiering. Placerar av obunden RNA och RNA: proteinkomplex indikeras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: splice webbplats växling assay validerar distinkta bindande särdrag av pyrimidin-bindande proteiner. (A-Top) Schematics av skarvning substratet. Den skarvning substrat innehåller en 5 ' splice plats och två alternativa 3 ' skarvar platser flanera intron. Rektanglar (öppna, med horisontella linjer och fasta) är exoner och linjen är en intron. (A-botten) hnRNP C1 förtrycker uppströms 3 ' splice Site (utan aktivering av nedströms 3 ' splice plats), medan PTB leder till aktivering av nedströms 3 ' splice plats. Skarvunderlaget inkuberades i ett HeLa cell kärn extrakt. De skarvning produkter (visas på sidorna) analyserades med hjälp av en primer Extension assay18 med splice-Junction primers (pilar), som erkänner skarvning av den gemensamma 5 "skarvar plats till antingen uppströms eller nedströms 3" splice plats. (B) REKOMBINANT U2AF65 (rU2AF65) reverserar den repressiva effekten av hnRNP C1. Tillsats av de rekombinanta hnRNP C1-, PTB-eller rU2AF65 -proteinerna till skarvreaktionen indikeras med +-symbolerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protein | Önskad sekvens (s) |
| U2AF65 | U-Rich innehållande CS |
| Sxl | U-Rich innehåller 2-4 GS |
| Ptb | UCUUC-rik med några GS |
| hnRNP C1 | U-Rich (5-6 lång) |
| CstF64 | GU-Rich |
| hnRNP E1/E2 och K | C-Rich |
| U2AF65/U2af35 heterodimer | UUUYYYYUNUAGGU |
Tabell 1: föredragna bindningsställen för vissa RNA-bindande proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nukleinsyra-bindande proteiner är viktiga regulatorer av djur-och växt utveckling. Ett nyckelkrav för SELEX-förfarandet är utvecklingen av ett test som kan användas för att separera proteinbundna och obundna RNA-fraktioner. I princip kan denna analys vara en in vitro-bindande analys, såsom filterbindande analys, gel Mobility Shift-analysen, eller ett matrisbindande test19 för rekombinanta proteiner, renade proteiner eller proteinkomplex. Analysen kan också vara en enzymatisk analys där prekursorer och produkter (eller intermediärer) kan separeras baserat på storlek eller på något annat sätt20.
Medan mutagenes har använts i stor utsträckning för att karakterisera bindningsställen för proteiner, är det mödosamt, och tidskrävande och längre sekvenser är inte lika lätt mottagliga för mättnad mutagenes. Betydelsen av den iterativa bindnings-och amplifieringsmetoden som beskrivs här är att inte bara övervinna några av ovanstående begränsningar, det kan framför allt identifiera tidigare okända bindnings platser och ge viktig information om nukleotidkrav vid varje position samtidigt.
En viktig faktor för framgången med iterativ urval-amplifiering är bindande tillhörighet och specificitet. Typiskt 12 till 15 rundor av urval-amplifiering används och ett sekvensutrymme på 1012 till 1015 molekyler kan rutinmässigt samplas. Förloppet och slutlig framgång för urvals-Amplification protokollet kan övervakas med hjälp av en bindande analys eller direkt sekvensering, som övervakar tillhörighet för eller berikning av specifika sekvenser i mellanliggande pooler, respektive. Medan bindnings analysen traditionellt användes, möjliggör tillkomsten av nästa generations sekvensering analys av sekvens berikning på ett sätt som inte är möjligt genom manuell Sanger sekvensering14.
Ett kritiskt steg i framgången för SELEX är vik anrikning av de önskade molekylerna vid varje steg. Antalet cykler som krävs för SELEX varierar och beror på flera faktorer. Till exempel, om veck-berikning av önskade eller specifika sekvenser är högre i varje runda, färre rundor kommer att räcka. Men om ett test tillåter en hög andel oönskade sekvenser i den bundna poolen, blir ytterligare rundor nödvändiga för att berika önskade RNA-sekvenser. En begränsning av tekniken eller en oavsiktlig konsekvens av behovet av ytterligare cykler av urvals förstärkning som måste hållas i åtanke är möjligheten att den kan införa artefakter eller berika sekvenser som har orelaterade egenskaper som deras förmåga att amplifiera. Slutligen, medan vissa applikationer gynnas av de högsta tillhörighets pärmarna, för andra användningar, måste en balans träffas under urvalsprocessen mellan bindningstillhörighet och funktion eftersom snäv bindnings sekvenser kanske inte nödvändigtvis de mest funktionella sekvenserna i biologiska sammanhang (t. ex. om en sekvens känns igen flera gånger av olika proteiner under splitsning).
Bland de ändringar och felsökning för att förbättra förfarandet, kan negativa val eller motverka urval användas för att öka specificitet. På samma sätt kan användning av olika partitionerings protokoll, såsom filterbindningsanalysen följt av gel Mobility Shift-analysen, eliminera anrikning av oönskade sekvenser som binder till exempel nitrocellulosa-filtret eller en Kolonnmatris21. Med tanke på att proteiner-nukleinsyra interaktioner har både specifika och icke-specifika komponenter, buffertförhållanden såsom salt och pH har effekter på RNA-proteininteraktioner. Användningen av lämplig proteinkoncentration kan dessutom ha en direkt effekt på bibehållandet av starka, svaga och icke-specifika bindemedel. Urvals trycket kan ökas i successiva omgångar, till exempel genom att inkludera en konkurrent RNA, minska protein koncentrationen, eller minska tiden för inkubering. Därför kan noggranna överväganden och optimera dessa parametrar påverka resultatet av SELEX-protokollet.
Nyligen har många variationer eller modifieringar av det ursprungliga SELEX-protokollet utvecklats som övervinner några av de begränsningar som nämns ovan. Dessa inkluderar hög genomströmning-SELEX (HT-SELEX), som kombinerar SELEX och massivt parallella sekvensering6, rnacompete, vilket innebär inkubation med överskott icke-slumpmässigt RNA, pull-down av det bundna RNA, fluorescerande märkning av RNA, och analys på Microarrays5, RNA bind-n-SEQ, som kombinerar RNA-tillhörighet analys i en kvantitativ och hög genomströmning mode22, och Rapid-Selex, som förkortar processen och innehåller en icke-amplifiering steg23.
Kemiskt modifierade baser har använts för att utöka repertoaren av RNA-molekylerna för specifika tillämpningar24. Diagnostik, Therapeutics, såväl som molekylar med katalytisk aktivitet är bland de många applikationerna (däribland i medicin) av de utvalda molekylarna25. Aptamers kompletterar antikroppsbaserade protokoll och ger utmärkta verktyg vars potential, till exempel i diagnostik, Therapeutics, och andra tillämpningar, återstår att utnyttjas fullt ut26,27,28. I framtiden, till exempel, kliniska fördelar är bland de många önskade ansökningarna, utöver vad den första FDA-godkända aptamer (pegaptanib natrium) kunde leverera för åldersrelaterade makuladegeneration. Den skalbara proteomiska tekniken för protein mätningar ger ett steg mot att förstå hälsa och sjukdomar24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar att han inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författaren tackar National Institutes of Health för tidigare finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
