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Genetics

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59635
Automatic Translation
1
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

Summary

Sequenzspezifität ist entscheidend für die Genregulation. Regulatorische Proteine, die bestimmte Sequenzen erkennen, sind wichtig für die Genregulation. Die Definition funktioneller Bindungsstellen für solche Proteine ist ein schwieriges biologisches Problem. Ein iterativer Ansatz zur Identifizierung einer Bindungsstelle für ein RNA-bindendes Protein wird hier beschrieben und ist auf alle RNA-bindenden Proteine anwendbar.

Abstract

Die Genregulation spielt in allen Zellen eine wichtige Rolle. Transkriptionale, posttranskriptionelle (oder RNA-Verarbeitung), translationale und posttranslationale Schritte werden verwendet, um bestimmte Gene zu regulieren. Sequenzspezifische Nukleinsäure-bindende Proteine zielen auf spezifische Sequenzen ab, um die räumliche oder zeitliche Genexpression zu steuern. Die Bindungsstellen in Nukleinsäuren sind typischerweise durch Mutationsanalyse gekennzeichnet. Zahlreiche Proteine von Interesse haben jedoch keine bekannte Bindungsstelle für eine solche Charakterisierung. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Identifizierung bisher unbekannter Bindungsstellen für RNA-bindende Proteine. Es beinhaltet iterative Auswahl und Verstärkung von Sequenzen beginnend mit einem randomisierten Sequenzpool. Nach mehreren Runden dieser Schritte-Transkription, Bindung und Verstärkung werden die angereicherten Sequenzen sequenziert, um eine bevorzugte Bindungsstelle(n) zu identifizieren. Der Erfolg dieses Ansatzes wird mit In-vitro-Bindungstests überwacht. Anschließend können in vitro und in vivo funktionelle Assays verwendet werden, um die biologische Relevanz der ausgewählten Sequenzen zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung einer bisher unbekannten Bindungsstelle(n) für jedes RNA-bindende Protein, für das ein Assay zur Trennung proteingebundener und ungebundener RNAs existiert.

Introduction

In der Zellbiologie spielt die Genregulation eine zentrale Rolle. In einem oder mehreren Schritten entlang des Genexpressionswegs haben Gene das Potenzial, reguliert zu werden. Diese Schritte umfassen Transkription (Initiierung, Dehnung und Beendigung) sowie Spleißen, Polyadenylierung oder 3' Endbildung, RNA-Export, mRNA-Translation und Zerfall/Lokalisierung von primären Transkripten. In diesen Schritten modulieren Nukleinsäure-bindende Proteine die Genregulation. Die Identifizierung von Bindungsstellen für solche Proteine ist ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der Genkontrolle. Mutationsanalyse und phylogenetischer Sequenzvergleich wurden verwendet, um regulatorische Sequenzen oder Proteinbindungsstellen in Nukleinsäuren wie Promotoren, Spleißstellen, Polyadenylierungselementen und Translationssignalen zu entdecken1, 2 , 3 , 4.

Pre-mRNA Spleißen ist ein integraler Schritt während der Genexpression und -regulation. Die Mehrheit der Säugetiergene, auch die beim Menschen, haben Introns. Ein großer Teil dieser Transkripte wird alternativ gespleißt, wodurch mehrere mRNA- und Protein-Isoformen aus demselben Gen oder Primärtranskript erzeugt werden. Diese Isoformen haben zellspezifische und entwicklungsspezifische Rollen in der Zellbiologie. Die 5' Spleißstelle, der Astpunkt und der Polypyrimidin-Trakt/3' Spleißstelle sind kritische Spleißsignale, die einer Regulierung unterliegen. Bei negativer Regulierung wird eine ansonsten starke Spleißstelle verdrängt, während bei positiver Regulierung eine ansonsten schwache Spleißstelle aktiviert wird. Eine Kombination dieser Ereignisse erzeugt eine Fülle von funktionell unterschiedlichen Isoformen. RNA-bindende Proteine spielen bei diesen alternativen Spleißereignissen eine Schlüsselrolle.

Es sind zahlreiche Proteine bekannt, deren Bindungsstellen oder RNA-Targets noch identifiziert werden müssen5,6. Die Verknüpfung von regulatorischen Proteinen mit ihren nachgelagerten biologischen Zielen oder Sequenzen ist oft ein komplexer Prozess. Für solche Proteine ist die Identifizierung ihrer Ziel-RNA oder Bindungsstelle ein wichtiger Schritt bei der Definition ihrer biologischen Funktionen. Sobald eine Bindungsstelle identifiziert ist, kann sie durch molekulare und biochemische Standardanalysen weiter charakterisiert werden.

Der hier beschriebene Ansatz hat zwei Vorteile. Erstens kann es eine bisher unbekannte Bindungsstelle für ein Protein von Interesse identifizieren. Zweitens besteht ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes darin, dass er gleichzeitig eine Sättigungsmutagenese ermöglicht, die ansonsten arbeitsintensiv wäre, um vergleichbare Informationen über Sequenzanforderungen innerhalb der Bindungsstelle zu erhalten. Somit bietet es ein schnelleres, einfacheres und kostengünstigeres Werkzeug, um Proteinbindungsstellen in der RNA zu identifizieren. Ursprünglich wurde dieser Ansatz (SELEX oder Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) verwendet, um die Bindungsstelle für die Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase (Gen 43-Protein) zu charakterisieren, die sich mit der Ribosom-Bindungsstelle in ihrer eigenen mRNA überlappt. Die Bindungsstelle enthält eine 8-Basis-Loop-Sequenz, die 65.536 randomisierte Varianten für die Analyse7darstellt. Zweitens wurde der Ansatz auch unabhängig verwendet, um zu zeigen, dass spezifische Bindungsstellen oder Aptamer für verschiedene Farbstoffe aus einem Pool von etwa 1013 Sequenzen8ausgewählt werden können. Tatsächlich wurde dieser Ansatz in vielen verschiedenen Kontexten verwendet, um Aptamer (RNA- oder DNA-Sequenzen) für die Bindung zahlreicher Liganden, wie Proteine, kleine Moleküle und Zellen, und für die Katalyse9zu identifizieren. Ein Aptamer kann beispielsweise zwischen zwei Xanthin-Derivaten, Koffein und Theophyllin, unterscheiden, die sich durch das Vorhandensein einer Methylgruppe in Koffein10unterscheiden. Wir haben diesen Ansatz (SELEX oder iterative Selektionsverstärkung) ausgiebig genutzt, um zu untersuchen, wie RNA-bindende Proteine in der Spleiß- oder Spleißverordnung11funktionieren, was die Grundlage für die anschließende Diskussion bilden wird.

Die zufällige Bibliothek: Wir haben eine zufällige Bibliothek mit 31 Nukleotiden verwendet. Die Längenbetrachtung für die zuzufällige Bibliothek beruhte lose auf der Idee, dass der allgemeine Spleißfaktor U2AF65 an eine Sequenz zwischen der Verzweigungspunktsequenz und der 3' Spleißstelle bindet. Im Durchschnitt liegt der Abstand zwischen diesen Spleißsignalen in Metazoen im Bereich von 20 bis 40 Nukleotiden. Ein anderes Protein Sex-lethal war dafür bekannt, sich an eine schlecht charakterisierte regulatorische Sequenz in der Nähe der 3' Spleißstelle seiner Ziel-Pre-mRNA, Transformator, zubinden. Daher wählten wir eine zufällige Region von 31 Nukleotiden, flankiert von Primerbindungsstellen mit Restriktionsenzymstellen, um die PCR-Verstärkung und Anhaftung des T7-RNA-Polymerase-Promotors für die In-vitro-Transkription zu ermöglichen. Die theoretische Bibliotheksgröße oder -komplexität betrug 431 oder ungefähr 1018. Wir verwendeten einen kleinen Bruchteil dieser Bibliothek, um unseren zufälligen RNA-Pool (1012-1015) für die unten beschriebenen Experimente vorzubereiten.

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Protocol

ANMERKUNG: Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der wichtigsten Schritte im iterativen Auswahl-Amplifikationsprozess (SELEX).

1. Generierung einer zufälligen Bibliotheksvorlage

  1. Synthetisieren Sie die Vorwärtsgrundierung 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' und die Reverse Primer 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer.
    HINWEIS: Die Primer und die zufällige Bibliothek können kommerziell synthetisiert werden.
  2. Synthetisieren Sie eine zufällige Bibliothek Oligonukleotid Vorlage 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N1... N31)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' durch chemische Synthese. Verwenden Sie ein äquimolares Gemisch aus vier Phosphoramiditen während der Synthese für die 31 randomisierten Positionen, die oben als N dargestellt sind.
    HINWEIS: Die Sequenz der Bibliotheksvorlage enthält 31 zufällige Nukleotide (N1 bis N31) und flankierende Sequenzen zur Bindung der Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung. Die Vorwärtsgrundierung umfasst die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz (unterstrichen) für die In-vitro-Transkription und eine Restriktionsstelle Bcl1 (italicisiert) zum Klonen. Die Reverse Primer enthält Restriktionsenzyme BamH1 und HindIII (italicized), um das Klonen zu erleichtern.

2. Generierung des DNA-Zufallsbibliothekspools

  1. Befestigen Sie den T7-RNA-Polymerase-Promotor an die Bibliothek durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die 1 -M-DNA-Zufallsbibliotheksschablone, 1 M m pro Primer, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 g/L Acetylylierungs-Serumalbumin, 2 Einheiten Taq- /c1> Polymerase und je 200 M dNTPs (Deoxyguanosin, Desoxyadenosin, Desoxycytidin und Desoxythymidintriphosphat).
  2. Verwenden Sie fünf Zyklen denaturier-, glüh- und Verlängerungsschritte (94 °C für 1 min, 53 °C für 1 min und 72 °C für 1 min) PCR gefolgt von einem Verlängerungszyklus (72 °C für 10 min).

3. Synthese von Pool 0 RNA

  1. Richten Sie eine 100-L-Transkriptionsreaktion12ein. Mix T7 Transkriptionspuffer, 1 M zufällige Bibliothekpool-DNA, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM Guanosintriphosphat (GTP), je 1 mM Adenosintriphosphat (ATP), Cytidintriphosphat (CTP) und Uridintriphosphat (UTP) und 2 Einheiten/L-RNA-Polymerase.
    HINWEIS: RNA kann in vitro mit handelsüblichen Kits mit einer Option der T7- oder SP6-RNA-Polymerase transkribiert werden.
  2. Inkubieren Sie das obige Reaktionsgemisch in einem Mikrozentrifugenrohr für 2 h bei 37 °C.
  3. Gel reinigen RNA in einem 10% denaturierenden Polyacrylamid-Gel.
  4. Identifizieren Sie die Position der Transkripte auf dem Gel, indem Sie es mit Methylenblau oder Autoradiographie beflecken, indem Sie Spuren von Radioaktivität (0,5 l oder weniger von32P UTP) in die Transkriptionsreaktion einbeziehen.
    1. Die Gelscheibe in ein Zentrifugenrohr geben und in kleinere Stücke brechen, z.B. mit einer Homogenisatorspitze. Fügen Sie Proteinase K (PK) Puffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% Natriumdodecylsulfat) hinzu, um die Gelstücke einzutauchen. Lassen Sie das Rohr auf einem Nutator von 2 h bis über Nacht bei Raumtemperatur.
  5. Drehen Sie in einer Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge (14.000 U/min oder 16.873 x g) 5 min bei Raumtemperatur, um den Gelabfall zu entfernen und die Pufferlösung wiederherzustellen.
  6. Wirbeln Sie die Probe zweimal mit einem gleichen Volumen von Phenol-Chlor-Form und einmal mit Chloroform.
  7. Mischen Sie die wässrige Phase von oben mit einem Zehntel Volumen Natriumacetat (3,0 M, pH 5,2), 10 g tRNA oder 20 g Glykogen und Ethanol (2–3 Volumen, bei -20 °C gelagert). Lassen Sie die Rohre bei -80 °C für 1 h.
  8. Drehen Sie die Rohre, die die Lösung für 5–10 min bei 4 °C in einer Mikrozentrifuge (14.000 U/min oder 16.873 x g) enthalten. Entsorgen Sie den Überstand sorgfältig. Spülen Sie das RNA-Pellet mit 70% Ethanol und drehen Sie für 2–5 min. Ethanol vorsichtig ansaugen. Das RNA-Pellet an der Luft trocknen.
  9. Löslichkeit des RNA-Pellets in 50 l Wasser, das mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt wird. Lassen Sie die Probe bei -20 °C zur Lagerung.
    HINWEIS: Reinigen Sie die RNA mit handelsüblichen Spinspalten, die derzeit häufiger zur Entfernung von Radioaktivität ohne inkorporierte Sukzessatik verwendet werden und als schnelle und bequemere Alternative zur RNA-Reinigung dienen.
    VORSICHT: Verwenden Sie einen Acrylglasschild, Handschuhe und andere Vorsichtsmaßnahmen, um vor Radioaktivität zu schützen.

4. Proteinbindungsreaktion und Trennung gebundener RNA

  1. Durchführung der Bindung von Protein und RNA in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 in einem Volumen von 100 l, indem Sie diesen Endkonzentrationen folgende Bestandteile hinzufügen: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 g/L Rinderserumalbumin, 0,5 Einheiten/L RNasin, 0,15 g/l tRNA , 1 mM EDTA und 30 L der entsprechenden rekombinanten Proteinkonzentration (PTB). Fügen Sie RNA aus dem entsprechenden Pool hinzu.
    ANMERKUNG: Der Spleißfaktor U2AF65 bindet typischerweise an die Polypyrimidin-Trakt/3' Spleißstellen von Modellintronen mit einer Bindungsaffinität (Gleichgewichtsdissoziationskonstante oder Kd) von etwa 1–10 nM. Daher wurden in den ersten beiden Bindungsrunden die Proteinkonzentration 10-fach über dem Kd für U2AF65verwendet; Für SXL- und PTB-Proteine war die Anfangskonzentration in diesem Bereich nur unsere beste Vermutung. Dies sorgte dafür, dass gewünschte RNA-Arten, die binden konnten, obwohl auch niedrigere Affinitätssequenzen potenziell gebunden wurden. In den Runden 3 und 4 (Transkription, Bindung und Verstärkung) wurde die Proteinkonzentration verdreifacht (Schritt 4.1). Dies wurde getan, um sukzessive Niedrigaffinität RNA-Arten zu beseitigen.
  2. Die Rohre mit den Bindereaktionen ca. 30 min bei 25 °C in einen Temperaturblock (oder auf Eis) legen.
  3. Fraktionieren Sie die gebundene RNA aus der ungebundenen RNA für die ersten 4 Runden der Selektionsverstärkung mit den folgenden Schritten.
    1. Filtern Sie die Probe (100 l) bei Raumtemperatur durch einen Nitrozellulosefilter, der an einem Vakuumkrümmer befestigt ist.
      HINWEIS: Der RNA-Protein-Komplex, aber nicht die ungebundene RNA, verbleibt auf dem Filter.
    2. Schneiden Sie den Filter mit zurückgehaltener RNA in Fragmente mit einer sterilen Rasierklinge; in ein Zentrifugenrohr einlegen. Erholen Sie die RNA, indem Sie die Röhre mindestens 3 h (oder über Nacht) mit Filterstücken, die in den Proteinase-K-Puffer (PK) eingetaucht sind, sanft stürzen.
    3. Deproteinisieren Sie die RNA-Probe, indem Sie sie in Gegenwart eines gleichen Volumens von Phenol-Chloroform (1:1) und dann von Chloroform wirbeln. Stellen Sie die wässrige Phase jedes Mal wieder her, indem Sie die Probe mit hoher Geschwindigkeit für 5 min bei Raumtemperatur zentrieren.
    4. Mischen Sie es mit Natriumacetat (0,1 Volumen von 3,0 M, pH 5,2) und Ethanol (2–3 Volumen absoluter Ethanol, 200 Proof). Lassen Sie das Rohr 30 min in einem -80 °C-Gefrierschrank, zentrifugieren Sie es 10 min lang mit hoher Geschwindigkeit und nach den Wasch- und Trocknungsschritten (Schritt 3.8) die RNA in mit DEPC behandeltem Wasser zu löslich. Diese Schritte sind oben beschrieben (Schritte 3.6 bis 3.9).
  4. Trennen Sie die proteingebundenen RNA-Fraktionen von den ungebundenen Fraktionen für die letzten 2 Runden (Runden 5 und 6; Transkription, Bindung und Verstärkung) wie folgt. Reduzieren Sie die Proteinkonzentration in der Bindungsreaktion (Schritt 4.1) um weiteres Dreifaches für zusätzlichen Selektionsdruck, um hochaffine Bindungssequenzen anzureichern und bevorzugt niedrigaffine Sequenzen zu entfernen.
    1. Vorguss eines nativen Polyacrylamidgels (5% mit 60:1 Acrylamid:bis-Acrylamid-Verhältnis) in 0,5x TBE-Puffer (Tris-Borate-EDTA) vor dem Aufbau der oben genannten RNA:Protein-Bindung (Schritt 4.1) Reaktion. Elektrophorese dieses Gel in einem kalten Raum (4 °C) durch Auftragen 250 V für 15 min.
    2. Pipette die oben genannten RNA:Protein-Bindungsreaktionen (Schritt 4.1) in verschiedene Brunnen dieses Gels.
      HINWEIS: Das Protein wird bei -80 °C gespeichert und vor der Verwendung in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-Ethanesulfonsäure (HEPES), pH 8,0, 20% Glycerin, 0,2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,05% NP-40 und 1 mM Dithiothreitol (DTT) verdünnt. Die Zugabe von 0,5–1,0 mM Proteasehemmer Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) ist optional. In der Bindungsreaktion trägt dieser Puffer etwa 6% Glycerin bei, was eine direkte Beladung von Proben in die Brunnen ermöglicht, ohne sie mit einem separaten Gel-Ladepuffer mischen zu müssen.
    3. Fraktionieren Sie die gebundene RNA aus der ungebundenen RNA mit Gelelektrophorese in einem kalten Raum (4 °C) bei 250 V für 1 bis 2 h. Dieser Prozess wird auch als Gel-Mobilitäts-Shift-Assay bezeichnet.
      HINWEIS: Die Dauer der Elektrophorese variiert je nach Denkcharakter der RNA und des Proteins, die für die Bindung verwendet werden.
    4. Setzen Sie das Gel einem Röntgenfilm aus und identifizieren Sie die Position der gebundenen RNA mithilfe der Autoradiographie. Schneiden Sie die Gelscheibe mit der gebundenen RNA aus und legen Sie sie in eine Röhre ein.
    5. Inkubieren Sie die zerkleinerte Gelscheibe im PK-Puffer, der für die Elution für 3 h oder über Nacht verwendet wird.
    6. Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte 3.5 bis 3.9. Kurz gesagt, wirbeln Sie die eluierte RNA-Probe kräftig zuerst mit Phenol-Chloroform und dann mit Chloroform.
    7. Natriumacetat und Ethanol mit der wässrigen Phase nach Chloroformextraktion vermischen. Nach der Inkubation im Gefrierschrank von -80 °C bei 4 °C für 5–10 min drehen, um das RNA-Pellet zu sammeln. Waschen Sie das RNA-Pellet mit Ethanol und trocknen Sie es an der Luft, indem Sie den Deckel des Rohres offen lassen. Lösen Sie die mit DEPC behandelte RNA in Wasser auf.
      HINWEIS: Der Wechsel zum Gel-Mobilitäts-Shift-Assay zur Fraktionierung ermöglicht die Eliminierung unerwünschter RNA-Arten, die beispielsweise für die Bindung angereichert worden sein könnten, zum Beispiel an den Nitrozellulosefilter hier (oder eine beliebige Matrix), der in den Anfangsrunden für die Fraktionierung verwendet wird.

5. Umgekehrte Transkription und PCR-Verstärkung

  1. Synthetisieren Sie cDNA aus der gelösten RNA mit Reverse-Transkriptase und dem Reverse Primer, indem Sie die 20-L-Reaktion (2 l von 10x RT-Puffer, 2 l AMV-Reverse-Transkriptase, 1 -M-Reverse-Primer, 10-L-RNA, RNase-Inhibitor optional) bei 42 °C für 60 min inkubieren.
  2. Verstärken Sie die cDNA mit 20–25 PCR-Zyklen, wie in Schritt 2.1 beschrieben.

6. Transkription und Proteinbindung

  1. Wiederholen Sie den Prozess der RNA-Synthese, Der Proteinbindung, der Trennung von proteingebundener und ungebundener Fraktion, wie in Abschnitt 3–5 oben beschrieben.

7. Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen

  1. Verwenden Sie den Gel-Mobilitäts-Shift-Assay (Schritt 4.4) oder den Filterbindungstest (Schritt 4.3), um Bindungsaffinität und Spezifität für ausgewählte Pools oder einzelne Sequenzen innerhalb jedes Pools zu bestimmen (siehe Schritt 8.3).
  2. Verwenden Sie Autoradiographie oder einen Phosphor-Imager, um Bänder im gebundenen und ungebundenen Bruch zu erkennen und zu quantifizieren.

8. Klonen und Sequenzieren

  1. Das endgültige PCR-DNA-Produkt mit den Restriktionsenzymen Bcl1 und HindIII für 1-2 h, Ligate mit dem entsprechend verdauten pGEM3 oder anderen Plasmiden, die die Restriktionsstellen von 2 h bis über Nacht transportieren, verdauen, das Ligationsprodukt in kompetente Bakterienzellen umwandeln durch Hitzeschock oder Elektroporation mit standardmolekularen Verfahren13.
  2. Wachsen Sie Bakterien über Nacht, indem Sie die transformierten Zellen auf Agarplatten mit Luria-Bertani (LB) Medium und Ampicillin (50 g/ml) bei 37 °C plattieren. Pflücken Sie Kolonien, um Kulturröhren zu impfen, die LB flüssiges Medium mit Ampicillin enthalten, und wachsen Sie bei 37 °C in einem Schüttelinkubator über Nacht. Reinigen Sie Plasmid-DNAs, die DNA-Einsätze enthalten, mit einem Standard-Plasmid-Isolationsprotokoll13.
    HINWEIS: Kommerzielle Kits sind für die Plasmidreinigung verfügbar.
  3. Sequenzieren Sie die Plasmide mit DNA-Einsätzen mit dem Dideoxy-Kettenbeendigungssequenzierungsprotokoll nach den Anweisungen des Herstellers zur Sequenzierung14.
    HINWEIS: Die Sequenzierung kann im Haus oder kommerziell durchgeführt werden.

9. Sequenzausrichtung

  1. Ausrichten von Sequenzen und Erzielung einer Konsensbindungsseite(en) mithilfe verfügbarer Online-Ausrichtungstools
    (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

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Representative Results

Die folgenden Beobachtungen zeigen eine erfolgreiche Selektionsverstärkung (SELEX). Zunächst analysierten wir Pool 0 und die ausgewählten Sequenzen zur Bindung an das Protein, das für den iterativen Selektionsamplifikationsansatz verwendet wird. Abbildung 2 zeigt, dass das Säugetier-Polypyrimidin-Trakt-Bindungsprotein (PTB) kaum nachweisbare Bindung an die Pool-0-Sequenz, aber eine hohe Affinität für den ausgewählten Sequenzpool zeigt. Es gab kaum nachweisbare Bindung an Pool 0, wenn wir etwa 300-fach höhere Proteinkonzentration für die Bindung als für den ausgewählten Pool verwendet. So gab es mindestens einen hundertfachen Unterschied in den Proteinbindungsaffinitäten zwischen dem zufälligen oder Startpool und dem ausgewählten Pool. Diese Beobachtung bestätigt experimentell, dass das hier beschriebene Selektions-Amplifikationsprotokoll erfolgreich ist.

Zweitens haben wir den ausgewählten Pool sequenziert und eine Konsensbindungsstelle festgelegt. Die Konsenssequenz, die bei der Angleichung der meisten ausgewählten Sequenzen aus dem von Säugetieren ausgewählten PTB-ausgewählten Pool erzielt wurde, war: GCCUG(Y/G)UGCYYYYYYG(Y/G)CCC. Dies zeigt, dass wir einzigartige Pyrimidin-reiche Sequenzen ausgewählt haben, die PTB11binden. Als wir eine iterative Selektionsamplifikation für die RNA-bindende Domäne der Drosophila PTB durchführten, bereicherten wir CU-reiche Sequenzen, die durch Guanosine unterbrochen wurden. Unter den hohen Affinitätssequenzen, die die Drosophila PTB ausgewählt hatte, war eine 84% Pyrimidin-reiche Sequenz: GCUUUCCUCUGUCGCCCUUCUUCGUCCCCUCUG. Tatsächlich ähnelt diese Sequenz der Pyrimidin-reichen Sequenz, die im Alpha-Tropomyosin-Intron vorhanden ist, das mit hoher Affinität zu dem Säugetier PTB15bindet und durch ihn reguliert wird. Wir haben diesen Ansatz wiederholt erfolgreich eingesetzt, um RNA-bindende Eigenschaften und Funktionen zu untersuchen, die Regulatoren und einen Spleißfaktor11,15,16spleißen. Tabelle 1 zeigt erfolgreiche Beispiele für RNA-bindende Proteine, für die SELEX verwendet wurde, um ihre bevorzugte oder konsensbindende Stelle(n) zu identifizieren.

Drittens zeigt ein In-vitro-Spleißtest, der auf der Alternativen 3' Spleißstelle basiert, die funktionelle Relevanz unterschiedlicher, aber überlappender RNA-bindender Spezifitäten von Polypyrimidin-Bindungsproteinen. Während standardmäßig eine vorgelagerte 3' Spleißstelle verwendet wird, führt die Zugabe der rekombinanten PTB zur Aktivierung des alternativen oder nachgelagerten 3' Spleißstandorts (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu führt die Zugabe von rekombinantem hnRNP C17 zur Unterdrückung der beiden 3' Spleißstellen. Die Zugabe des rekombinanten allgemeinen Spleißfaktors U2AF65 kehrt die hnRNP C1-vermittelte 3' Spleiß-Site-Repression (Abbildung 3) sowie den PTB-vermittelten Effekt auf die Aktivierung der nachgeschalteten 3-Splice-Site um (Daten werden nicht angezeigt). Eine einfache Erklärung für diese Effekte ist ein direkter Wettbewerb zwischen der Bindung des allgemeinen Spleißfaktors U2AF65 und PTB (auch hnRNP I genannt), die bevorzugt an bestimmte 3' Spleißstellen bindet und diese unterdrückt, oder zwischen U2AF65 und hnRNP C, das an beide 3' Spleißstellen bindet und diese unterdrückt.

Figure 1
Abbildung 1: Zusammenfassung der wichtigsten Schritte im iterativen Selektionsamplifikationsprozess (SELEX). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Anreicherung von PTB-bindenden RNAs. Die zunehmende Konzentration (gefüllte Dreiecke) der rekombinanten PTB wurde entweder mit radioaktiv markiertem Pool 0 RNA oder dem ausgewählten Pool verwendet, der nach sechs Runden der Selektion und Verstärkung erhalten wurde. Positionen ungebundener RNA und des RNA:protein-Komplexes sind indiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Splice-Standort-Switching-Assay validiert unterschiedliche Bindungsspezifitäten von Pyrimidin-bindenden Proteinen. (A-Top) Schemata des Spleißsubstrats. Das Spleißsubstrat enthält eine 5' Spleißstelle und zwei alternative 3' Spleißstellen, die das Intron flankieren. Rechtecke (offen, mit horizontalen Linien und Volumenkörper) sind Exons und die Linie ist ein Intron. (A-unten) hnRNP C1 unterdrückt die vorgelagerte 3' Spleißstelle (ohne Aktivierung der nachgelagerten 3' Spleißstelle), während PTB zur Aktivierung der nachgelagerten 3' Spleißstelle führt. Das Spleißsubstrat wurde in einem HeLa-Zell-Kernextrakt inkubiert. Die Spleißprodukte (an den Seiten dargestellt) wurden mit einem Primer-Verlängerungstest18 mit Spleiß-Kreuzungs-Primern (Pfeilen) analysiert, die das Spleißen der gemeinsamen 5' Spleißstelle entweder an der vor- oder nachgelagerten 3' Spleißstelle erkennen. (B) Rekombinantes U2AF65 (rU2AF65) kehrt die repressive Wirkung von hnRNP C1 um. Die Zugabe der rekombinanten hnRNP C1-, PTB- oder rU2AF 65-Proteine zur Spleißreaktion wird durch die +-Symbole angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

protein Bevorzugte Sequenz(en)
U2AF65 U-reiche Cs
Sxl U-reich mit 2-4 Gs
Ptb UCUUC-reich mit einigen Gs
hnRNP C1 U-reich (5-6 lang)
CstF64 GU-reich
hnRNP E1/E2 und K C-reich
U2AF65/U2AF35 Heterodimer UUUYYYYYUNUAGGU

Tabelle 1: Bevorzugte Bindungsstellen für einige RNA-bindende Proteine.

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Discussion

Nukleinsäurebindende Proteine sind wichtige Regulatoren der Tier- und Pflanzenentwicklung. Eine wesentliche Voraussetzung für das SELEX-Verfahren ist die Entwicklung eines Assays, mit dem proteingebundene und ungebundene RNA-Fraktionen getrennt werden können. Im Prinzip kann dieser Assay ein In-vitro-Bindungstest wie der filterbindende Assay, der Gel-Mobilitäts-Shift-Assay oder ein Matrix-Bindungstest19 für rekombinante Proteine, gereinigte Proteine oder Proteinkomplexe sein. Der Assay kann auch ein enzymatischer Assay sein, bei dem die Vorstufen und Produkte (oder Zwischenprodukte) je nach Größe oder einem anderen Mittel20getrennt werden können.

Während Mutagenese weit verbreitet ist, um Bindungsstellen für Proteine zu charakterisieren, ist sie mühsam, und zeitaufwändige und längere Sequenzen sind nicht so leicht für Sättigungsmutagenese zugänglich. Die Bedeutung des hier beschriebenen iterativen Bindungs- und Amplifikationsansatzes besteht darin, dass er nicht nur einige der oben genannten Einschränkungen überwindet, sondern vor allem bisher unbekannte Bindungsstellen identifizieren und wichtige Informationen über Nukleotidanforderungen an jeder Position gleichzeitig.

Ein wichtiger Aspekt für den Erfolg iterativer Selektionsverstärkung ist die Bindungsaffinität und Spezifität. In der Regel werden 12 bis 15 Runden selektionsverstärkend eingesetzt und ein Sequenzraum von 1012 bis 1015 Molekülen routinemäßig beprobt werden. Der Fortschritt und der letztendliche Erfolg des Auswahl-Amplifikationsprotokolls können mit einem Bindungstest bzw. einer direkten Sequenzierung überwacht werden, die die Affinität bzw. Anreicherung bestimmter Sequenzen in Zwischenpools überwacht. Während der Bindungstest traditionell verwendet wurde, ermöglicht das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation die Analyse der Sequenzanreicherung auf eine Weise, die durch manuelle Sanger-Sequenzierung14nicht möglich ist.

Ein entscheidender Schritt zum Erfolg von SELEX ist die Faltenanreicherung der gewünschten Moleküle bei jedem Schritt. Die Anzahl der für SELEX erforderlichen Zyklen variiert und hängt von mehreren Faktoren ab. Wenn z. B. die Faltanreicherung der gewünschten oder bestimmten Sequenzen in jeder Runde höher ist, reichen weniger Runden aus. Wenn ein Assay jedoch einen hohen Anteil an unerwünschten Sequenzen im gebundenen Pool zulässt, werden zusätzliche Runden notwendig, um die gewünschten RNA-Sequenzen zu bereichern. Eine Einschränkung der Technik oder eine unbeabsichtigte Folge der Notwendigkeit zusätzlicher Selektionsamplifikationszyklen, die zu beachten sind, ist die Möglichkeit, dass sie Artefakte einführen oder Sequenzen anreichern könnte, die nicht verwandte Eigenschaften wie Fähigkeit zu verstärken. Während einige Anwendungen von den höchsten Affinitätsbindern profitieren, muss bei anderen Verwendungen während des Auswahl-Amplifikations-Prozesses ein Gleichgewicht zwischen Bindungsaffinität und Funktion gefunden werden, da engste Bindungssequenzen möglicherweise nicht notwendigerweise die funktionalsten Sequenzen in biologischen Kontexten (z.B. wenn eine Sequenz beim Spleißen mehrfach von verschiedenen Proteinen erkannt wird).

Unter den Änderungen und Fehlerbehebung, um das Verfahren zu verbessern, kann negative Auswahl oder Zählerauswahl verwendet werden, um die Spezifität zu erhöhen. Ebenso kann die Verwendung verschiedener Partitionierungsprotokolle, wie z. B. des Filterbindungstestes gefolgt vom Gel-Mobilitäts-Shift-Assay, die Anreicherung unerwünschter Sequenzen eliminieren, die z.B. an den Nitrozellulosefilter oder eine Säulenmatrixbinden 21. Da Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen sowohl spezifische als auch unspezifische Komponenten haben, haben Pufferbedingungen wie Salz und pH Auswirkungen auf DIE Wechselwirkungen zwischen RNA und Protein. Darüber hinaus kann die Verwendung einer geeigneten Proteinkonzentration einen direkten Effekt auf die Retention von starken, schwachen und unspezifischen Bindemitteln haben. Der Selektionsdruck kann in aufeinanderfolgenden Runden erhöht werden, z. B. durch Einbeziehung einer Konkurrenz-RNA, Verringerung der Proteinkonzentration oder Verkürzung der Inkubationszeit. Daher können sorgfältige Überlegungen und die Optimierung dieser Parameter das Ergebnis des SELEX-Protokolls beeinflussen.

Kürzlich wurden viele Variationen oder Modifikationen des ursprünglichen SELEX-Protokolls entwickelt, die einige der oben genannten Einschränkungen überwinden. Dazu gehören hochdurchsatz-SELEX (HT-SELEX), das SELEX und massiv parallele Sequenzierung6, RNAcompete kombiniert, die Inkubation mit überschüssiger nicht zufälliger RNA, Pull-down der gebundenen RNA, fluoreszierende Kennzeichnung von RNA und microarrays5, RNA Bind-n-Seq, die RNA-Affinitätsanalyse in quantitativer und hoher Durchsatz-Manier22kombiniert, und RAPID-SELEX, die den Prozess verkürzt und einen Nicht-Amplifikationsschritt23enthält.

Chemisch modifizierte Basen wurden verwendet, um das Repertoire der RNA-Moleküle für spezifische Anwendungen zu erweitern24. Diagnostik, Therapeutika sowie Moleküle mit katalytischen Aktivitäten gehören zu den vielen Anwendungen (auch in der Medizin) der ausgewählten Moleküle25. Aptamer ergänzen Antikörper-basierte Protokolle und bieten hervorragende Werkzeuge, deren Potenzial beispielsweise in der Diagnostik, Therapeutika und anderen Anwendungen noch voll ausgeschöpft werden muss26,27,28. In Zukunft gehören beispielsweise klinische Vorteile zu den zahlreichen gewünschten Anwendungen, die über das hinausgehen, was das erste von der FDA zugelassene Aptamer (Pegaptanib-Natrium) für die altersbedingte Makuladegeneration liefern könnte. Die skalierbare proteomische Technologie für Proteinmessungen bietet einen Schritt zum Verständnis von Gesundheit und Krankheiten24.

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Disclosures

Der Autor erklärt, dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Acknowledgments

Der Autor dankt den National Institutes of Health für die bisherige Finanzierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
Glass Plates Standard Standard
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
polyacrylamide gel solutions Standard Standard
Proteinase K NEB P8107S
Recombinant PTB Laboratory Preparation Not applicable
Reverse Transcriptase NEB M0277S
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films Standard Standard

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References

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Tags

Genetik Ausgabe 150 RNA-bindendes Protein iterative Selektionsverstärkung Spleißen Polypyrimidin-Trakt/3'splice-Site SELEX Sequenzentwicklung in einem Reagenzglas
Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine
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Singh, R. Exploring Sequence Space… More

Singh, R. Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59635, doi:10.3791/59635 (2019).

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