Espressione rapida ed efficiente di più proteine negli embrioni aviari utilizzando l'elettroporazione dell'mRNA
Summary
Riportiamo l’elettroporazione messaggera RNA (mRNA) come un metodo che permette l’espressione rapida ed efficiente di più proteine nel sistema del modello embrionale di quaglia. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare le cellule fluorescenti e registrare i loro movimenti in vivo mediante microscopia time-lapse poco dopo l’elettroporazione.
Abstract
Riportiamo che l’elettroporazione dell’mRNA consente alle proteine fluorescenti di etichettare le cellule negli embrioni di quaglia viventi più rapidamente e in generale rispetto all’elettroporazione del DNA. L’elevata efficienza di trasfezione consente di co-trasfetare almeno 4 mRNA distinti con un’efficienza dell’87%. La maggior parte degli mRNA elettroporate sono degradati durante i primi 2 h dopo l’elettroporazione, permettendo di effettuare esperimenti sensibili al tempo nell’embrione in via di sviluppo. Infine, descriviamo come immaginire dinamicamente embrioni vivi elettroporate con mRNA che codificano varie proteine fluorescenti subcellulari mirate.
Introduction
L’elettroporazione è un metodo di trasfezione fisica che utilizza un impulso elettrico per creare pori transitori nella membrana plasmatica, permettendo a sostanze come gli acidi nucleici o le sostanze chimiche di passare nel citosol. L’elettroporazione è ampiamente utilizzata per fornire DNA in batteri, lieviti, piante e cellule di mammiferi1,2,3. Viene regolarmente utilizzato per introdurre carichi genetici nelle cellule bersaglio e nei tessuti all’interno dell’embrione aviario in via di sviluppo per studiare il controllo genetico dello sviluppo o etichettare le popolazioni migratorie di cellule4,5,6, 7. Tuttavia, esistono anche diverse limitazioni sperimentali con l’elettroporazione del DNA8. Per esempio, l’elettroporazione del DNA spesso introduce un numero altamente variabile di vettori di espressione per cellula e successivamente gli mRNA e le proteine che codificano. Questa variabilità può portare a una notevole eterogeneità cellulare-cellula che complica sia l’analisi dell’immagine che l’interpretazione dei dati9,10. Inoltre, le proteine dell’elettroporazione del DNA iniziano solo ad esprimere 3 h dopo l’elettroporazione e non raggiungono la massima efficienza nel numero di cellule e nell’intensità della fluorescenza fino a 12 h, probabilmente a causa del tempo necessario per il trasferimento nel nucleo e il completamento sia la trascrizione che la traduzione in vivo11.
Al contrario, la trafezione dell’mRNA è stata utilizzata efficacemente in una varietà di sistemi modello, tra cui Xenopus laevis oeciti per microiniezione12,13, riprogrammando le cellule staminali umane mediante trasfezione di lipofectamina di mRNA14 ed elettroporare le cellule staminali neurali nei topi adulti15. Abbiamo testato la capacità dell’elettroporazione dell’mRNA di etichettare in modo efficiente le cellule durante lo sviluppo embrionale aviaria precoce utilizzando mRNA sintetizzati in vitro che codificano proteine fluorescenti distinte (FP). Per i nostri studi, abbiamo utilizzato il vettore pCS2, un vettore di espressione multiuso che viene comunemente utilizzato per esprimere proteine negli embrioni di Xenopus e di pesce zebra. I promotori di polimerasi dell’RNA SP6 e T7 nel pCS2 consentono la sintesi di mRNA e proteine da qualsiasi gene clonato se usato in un sistema di trascrizione/traduzione in vitro.
Qui, dimostriamo che l’elettroporazione dell’mRNA consente un’espressione rapida ed efficiente delle proteine fluorescenti (FP) negli embrioni di quaglia gastrulanti. Abbiamo progettato e generato molti dei vettori di espressione utilizzati in questi studi. Ad esempio, abbiamo sottoclone del gene LifeAct-eGFP16 nel vettore pCS217 per esprimere dal promotore CMV e dal promotore SP6. Il gene inserito si trova a valle del promotore SP6 e a monte della coda18poli SV40. Negli embrioni co-elettropolizzati con mRNA e DNA, gli FP codificati da mRNA trascritti in vitro sono stati rilevati per la prima volta entro 20 min dall’elettroporazione, mentre le FP dei vettori di espressione del DNA sono state rilevate solo dopo 3 h. La codifica multipla degli mRNA per il nucleare, il Golgi e le proteine della membrana possono essere elettroporate in un embrione contemporaneamente, con conseguente espressione rapida ed efficiente di più proteine nelle singole cellule. Infine, utilizzando un recupero di fluorescenza in vivo dopo il fotobleaching (FRAP), mostriamo che la maggior parte dei mRNA elettroporate decade entro 2 h. Pertanto, una rapida produzione iniziale di proteine combinata con una nuova traduzione proteica limitata rende l’elettroporazione dell’mRNA una tecnica preziosa quando è necessario il controllo temporale dell’espressione.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo fornito istruzioni passo dopo passo su come microiniettare ed elettroporate precisamente l’mRNA nelle cellule degli embrioni di quaglia gastrulanti. Abbiamo dimostrato che l’elettroporazione dell’mRNA in vitro sintetizzata consente un’espressione rapida ed efficiente delle proteine fluorescenti (FP) negli embrioni di quaglia gastrulanti (Figura 2 e 3). La fluorescenza dalla proteina H2B-citriga tradotta da mRNA elettroporati potrebbe essere rile…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo David Huss per informazioni utili su questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) e dalla USC Provost’s Undergrad Research Fellowship a M.T., dal Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award a M.D., e dall’Università di Premio Del Southern California Undergraduate Research Associates Program a R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
Riferimenti
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