JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
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Biologia dello sviluppo

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

Published: June 07, 2019
doi:
10.3791/59664
, ,
1Department of Biological Sciences,University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute,Children’s Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology,University of Southern California, Los Angeles

Summary

ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。

Abstract

我々は、mRNAエレクトロポレーションにより、生きているウズラ胚の細胞にDNAエレクトロポレーションよりも迅速かつ広範に標識する蛍光タンパク質を可能にすることを報告する。高いトランスフェクション効率は、少なくとも4つの異なるmRNAを~87%の効率で共生することを可能にします。電化mRNAのほとんどは、最初の2時間のエレクトロポレーションの間に分解され、発達中の胚で時間に敏感な実験を行うことを可能にする。最後に、様々な細胞内標的蛍光タンパク質をコードするmRNAでエレクトロポレートされた生きた胚を動的に画像化する方法について述べた。

Introduction

エレクトロポレーションは、電気パルスを使用してプラズマ膜内に一時的な細孔を作り出し、核酸や化学物質などの物質がサイトソールに入り込むことを可能にする物理的なトランスフェクション方法です。エレクトロポレーションは、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞1、2、3にDNAを提供するために広く使用されています。これは、発達中の鳥胚内の標的細胞および組織に遺伝的ペイロードを導入するために日常的に使用され、細胞4、5、6、細胞の集団の遺伝子制御または標識移動の遺伝子制御を研究する。 7.しかし、DNAエレクトロポレーション8にはいくつかの実験的な制限も存在する。例えば、DNAエレクトロポレーションは、多くの場合、細胞あたりの発現ベクターの非常に可変数を導入し、その後、それらがコードするmRNAとタンパク質を導入します。この変動性は、画像解析とデータ解釈9、10の両方を複雑にするかなりの細胞細胞の不均一性につながる可能性があります。さらに、DNAエレクトロポレーションからのタンパク質は、エレクトロポレーション後3時間しか発現し始め、12時間まで細胞数と蛍光強度の最大効率に達せず、核への転移に要する時間が原因で完了する可能性が高い。生体内11の転写と翻訳の両方.

対照的に、mRNAトランスフェクションは、マイクロインジェクション12、13によるキセノプス・レービス卵母細胞、mRNAリポフェクタミントランスフェクション14によるヒト幹細胞の再プログラミングを含む様々なモデルシステムで効果的に使用されている。、成体マウス15における再石灰性神経幹細胞を電気的にする。我々は、異なる蛍光タンパク質(GP)をコードするインビトロ合成mRNAを用いて、初期の鳥類胚発生時に細胞を効率的に標識するmRNAエレクトロポレーションの能力を試験した。我々の研究では、キセノプスおよびゼブラフィッシュ胚のタンパク質を発現するために一般的に使用される多目的発現ベクターであるpCS2+ベクターを用いて使用した。pCS2+におけるSP6およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターは、インビトロ転写/翻訳システムで使用した場合、任意のクローン遺伝子からのmRNAおよびタンパク質の合成を可能にします。

ここでは、mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証する。我々は、これらの研究で使用される発現ベクターの多くを設計し、生成した。例えば、LifeAct-eGFP遺伝子16をpCS2+ベクター17にサブクローニングし、CMVプロモーターおよびSP6プロモーターから発現した。挿入された遺伝子は、SP6プロモーターの下流にあり、SV40ポリ(A)テール18の上流にある。mRNAとDNAと共にエレクトロポレートされた胚では、インビトロ転写されたmRNAからコードされた胎児は、最初にエレクトロポレーションの20分以内に検出されたが、DNA発現ベクターからのGPは、核、ゴルジ、および核をコードする複数のmRNAの3時間後にのみ検出された。膜タンパク質は同時に胚にエレクトロポレートされ、個々の細胞内の複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現をもたらす。最後に、光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収を用いて、電ポレートされたmRNAの大部分が2時間以内に崩壊することを示す。したがって、限られた新しいタンパク質翻訳と組み合わせた高速初期タンパク質産生は、発現の時間的制御が必要な場合にmRNAエレクトロポレーションを貴重な技術にする。

Protocol

すべての動物の手順は、小児病院ロサンゼルスと南カリフォルニア大学機関動物ケアおよび使用委員会からの承認されたガイドラインに従って行われました。 1. 生成 pCS2 ベースの式ベクトル pCS2.Lifeact-eGFPをクローンするには、適切な消化バッファー(材料の表を参照)でBamHI(10U)とBsrGI(10 U)を用いてpCS2.CycB1-GFP(異なるインサートを含む構造体)の2μgを消化してベ…

Representative Results

mRNAエレクトロポレーションはDNAエレクトロポレーションよりも効率的 私たちはpCS2+を使用しました。H2B-シトリンは、mRNAをインビトロで調製する。DNAエレクトロポレーションは通常1-2 μg/μLで行われるため、mRNAエレクトロポレーションにはmRNAの等化濃度(H2B-シトリンの場合は約0.25-0.5 μg/μL)を用いました。ま?…

Discussion

このプロトコルでは、ウズラ胚をガストレーションする細胞にmRNAを正確にマイクロインジェクトして電気ポレートする方法について段階的に説明しました。インビトロ合成mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証した(図2および3)。電気起電mRNAから翻訳さ…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品に役立つ洞察をデビッド・ハスに感謝します。この研究は、ローズヒルズ財団サマーリサーチフェローシップ(2016-2018)とUSCプロボストのM.T.、サバン研究所内壁画研修前博士賞、および大学の一部で支援されました。南カリフォルニア学部研究員プログラム賞

Materials

BamHI-HF New England Biolabs R3136L
BglII New England Biolabs R0144S
BsrG1-HF New England Biolabs R3575S
NotI-HF New England Biolabs R3189L
SalI-HF New England Biolabs R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Thermo Fisher 15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit Thermo Fisher AM1340
Fast Green FCF Sigma Aldrich F7252
Triton X-100 Sigma Aldrich 93443 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI Sigma Aldrich D9542 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper Sigma Aldrich WHA1001125
glycerol Sigma Aldrich G9012
Urea Sigma Aldrich 51457
pmTurquoise2-Golgi Addgene 36205 pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP Addgene This paper
pCS.H2B-citrine Addgene 53752 pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry Addgene #53750 pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm Bex Co., Ltd. LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100
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Riferimenti

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Biologia dello sviluppo. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Biologia dello sviluppo. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Biologia dello sviluppo. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).

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Keywords: MRNA ElectroporationAvian EmbryoProtein ExpressionFluorescent ProteinsTransient TransfectionDevelopmental StageElectroporation ChamberEpiblastVitelline MembraneFluorescent Imaging
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Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).
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