mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현
1Department of Biological Sciences,University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute,Children’s Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology,University of Southern California, Los Angeles
Summary
우리는 메추라기 배아 모델 시스템에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현을 허용하는 방법으로 메신저 RNA (mRNA) 전기 를 보고합니다. 이 방법은 형광성 으로 세포를 표지하고 전기 개공 직후 시간 경과 현미경 검사법에 의해 생체 내 움직임을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
우리는 mRNA 전기 가기는 살아있는 메추라기 배아에 있는 세포에 DNA 전기 포공 보다는 더 빠르고 광범위하게 표지하기 위하여 형광성 단백질을 허용한다는 것을 보고합니다. 높은 형질감염 효율은 적어도 4개의 별개의 mRNAs가 ~87% 효율로 공동 형질감염되는 것을 허용합니다. 대부분의 전기 포어mAs는 처음 2시간 동안 전기 천공 후 저하되어 개발 배아에서 시간에 민감한 실험이 수행될 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 다양한 세포내 표적 형광 단백질을 인코딩하는 mRNAs로 전기화된 살아있는 배아를 동적으로 이미지화하는 방법을 설명합니다.
Introduction
전기 개출은 전기 펄스를 사용하여 플라즈마 막에 일시적인 기공을 생성하여 핵산이나 화학 물질과 같은 물질이 시토솔로 전달되도록하는 물리적 형질 감염 방법입니다. 전기 천공은 박테리아, 효모, 식물 및 포유류 세포1,2,3으로DNA를 전달하는 데 널리 사용됩니다. 그것은 일상적으로 세포의 개발 또는 라벨 이동 세포의 유전 제어를 연구하기 위해 개발 조류 배아 내에서 대상 세포와 조직에 유전 페이로드를 소개하는 데 사용4,5,6, 7. 그러나 DNA 전기 화 8과 관련하여몇 가지 실험적 한계가 존재합니다. 예를 들면, DNA 전기천공은 수시로 세포 당 발현 벡터의 높게 가변적인 수를 소개하고 그 후에 mRNAs 및 단백질은 그(것)들이 인코딩합니다. 이러한 가변성은 이미지 분석과 데이터 해석을 모두 복잡하게 하는 상당한 세포 세포 이질성으로 이어질 수있다9,10. 추가적으로, DNA 전기 천공에서 단백질은 단지 발현하기 시작 ~3 시간 후 전기 천공및 12 시간까지 세포 수와 형광 강도의 최대 효율에 도달하지 않습니다, 가능성이 때문에 핵으로 전달하고 완료하는 데 필요한 시간 생체 내 전사 및 번역모두 11.
대조적으로, mRNA 형질감염은 미세주입12,13,mRNA lipofectamine 형질감염에 의한 인간 줄기세포를 재프로그래밍하여 제노푸스 라에비스 난모세포를 포함한 다양한 모델 시스템에서 효과적으로 사용되고 있다14 , 성인 마우스15에서반응성 신경 줄기 세포를 전기화. 우리는 별개의 형광 성 단백질 (FPs)를 인코딩하는 시험관 내 합성 mRNAs를 사용하여 초기 조류 배아 발달 중에 세포를 효율적으로 라벨링하는 mRNA 전기 화기의 능력을 테스트했습니다. 우리의 연구를 위해, 우리는 pCS2+ 벡터, 제노푸스와 얼룩말 배아에서 단백질을 발현하기 위해 일반적으로 사용되는 다목적 발현 벡터를 사용했습니다. pCS2+에 있는 SP6 및 T7 RNA 중합효소 프로모터는 시험관 내 전사/번역 시스템에서 사용될 때 어떤 복제된 유전자든지에서 mRNA 그리고 단백질의 합성을 허용합니다.
여기에서, 우리는 mRNA 전기 천공이 메추라기 배아를 가두기에서 형광 성 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 보여줍니다. 우리는 이러한 연구에 사용되는 많은 발현 벡터를 설계하고 생성했습니다. 예를 들어, 우리는 LifeAct-eGFP 유전자16을 CMV 프로모터 및 SP6 프로모터로부터 발현하기 위해 pCS2+ 벡터17로 subcloned하였다. 삽입된 유전자는 SP6 프로모터의 하류및 SV40 폴리(A)꼬리(18)의 상류에 놓여 있다. mRNA 및 DNA와 함께 전기화된 배아에서, 시험관내 전사 mRNAs에서 부호매겨진 FPs는 전기 천공의 20 분 안에 처음 검출된 반면, DNA 발현 벡터에서 FPs는 3 시간 후에만 검출되었습니다. 막 단백질은 동시에 배아로 전기화될 수 있어 개별 세포에서 여러 단백질을 빠르고 효율적으로 발현할 수 있습니다. 마지막으로, 광표백(FRAP) 분석 후 생체 내 형광 회복을 사용하여, 우리는 대부분의 전기포케이트 mRNAs가 2시간 내에 붕괴되는 것을 보여준다. 따라서, 제한된 새로운 단백질 번역과 결합된 빠른 초기 단백질 생산은 mRNA 전기화를 발현의 시간적 조절이 필요할 때 귀중한 기술로 만든다.
Protocol
모든 동물 절차는 로스 앤젤레스 어린이 병원과 남부 캘리포니아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 생성 pCS2 기반 발현 벡터 pCS2.Lifeact-eGFP를 복제하려면, 2 μg의 pCS2.CycB1-GFP(다른 인서트를 포함하는 구조)를 BamHI(10 U)와 BsrGI(10 U)와 적절한 소화 완충제(재료 표 참조)로 소화하여 벡터 백본을 총 반응에서 1배로 희석하여 …
Representative Results
mRNA 전기 화는 DNA 전기 화보다 더 효율적입니다. 우리는 pCS2 +를 사용했습니다. H2B-시트린은 시험관내 전사 mRNA를 준비한다. DNA 전기화는 일반적으로 1-2 μg/μL에서 수행되기 때문에 mRNA 전기화에 대해 mRNA(H2B-Citrine의 경우 약 0.25-0.5 μg/μL로 계산)의 등쪽 농도를 사용했습니다. 우리는 먼저 pCS2+의 전기 개광 효율을 테?…
Discussion
이 프로토콜에서는 메추라기 배아를 가스투압하는 세포로 mRNA를 정밀하게 미세 주입하고 전기 포어하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공했습니다. 우리는 시험관 내 합성 mRNA 전기화가 메추라기 배아에서 형광 단백질 (FPs)의 빠르고 효율적인 발현을 허용한다는 것을 입증했습니다 (그림2 및 3). 전기 포공 mRNAs에서 번역된 H2B-시트린 단백질로부터의 형광은 ~ 20분…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 작품에 도움이 통찰력을 데이비드 Huss 감사합니다. 이 작품은 로즈 힐스 재단 여름 연구 펠로우십 (2016-2018)과 USC Provost의 언더 그라드 연구 펠로우십M.T., 사반 연구소 교내 교육 박사 전 박사 상, 그리고 대학에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 남부 캘리포니아 학부 연구 어소시에이트 프로그램 수상
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Tran, M., Dave, M., Lansford, R. Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation. J. Vis. Exp. (148), e59664, doi:10.3791/59664 (2019).