ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग
Summary
आरएनए पॉलिमरेज के साथ प्रतिलेखन कारकों (टीएफएस) की बातचीत आमतौर पर पुलडाउन परख का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है। हम क्लैमिडियल आरएनए पॉलिमरेज के साथ GrgA की बातचीत की विशेषता के लिए एक Biolayer इंटरफेरोमेट्री (BLI) प्रौद्योगिकी लागू होते हैं। pulldown assays की तुलना में, BLI वास्तविक समय संघ और वियोजन का पता लगाता है, उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है, और अत्यधिक मात्रात्मक है.
Abstract
एक प्रतिलेखन कारक (TF) एक प्रोटीन है कि आरएनए polymerase, एक और TF, और / GrgA एक उपन्यास प्रतिलेखन उत्प्रेरक है जो विशेष रूप से अविकल्पी इंट्रासेल्यूलर जीवाणु रोगज़नक़ क्लैमिडिया में पाया जाता है। एफ़िनिटी मोतियों का उपयोग करके प्रोटीन पुलडाउन परखसे गए हैं कि GrgA दो कारकों को बांधता है, अर्थात्66 और $28,जो जीनों के लिए प्रमोटरों के विभिन्न सेटों को पहचानते हैं जिनके उत्पादों की विकासात्मक अवस्थाओं में अंतर की आवश्यकता होती है। हम की पुष्टि करने के लिए और आगे बातचीत की विशेषता BLI का इस्तेमाल किया है. BLI pulldown पर कई फायदे दर्शाता है: 1) यह बाध्यकारी भागीदारों के बीच वास्तविक समय संघ और वियोजन से पता चलता है, 2) यह मात्रात्मक गतिज पैरामीटर उत्पन्न करता है, और 3) यह बाइंडिंग कि pulldown परख अक्सर पता लगाने में विफल का पता लगा सकते हैं. इन विशेषताओं ने क्लैमिडिया में जीन अभिव्यक्ति विनियमन में ग्राम की शारीरिक भूमिकाओं और संभावित विस्तृत अन्योन्यक्रिया तंत्रों को कम करने में सक्षम बना दिया है. हम कल्पना है कि यह अपेक्षाकृत सस्ती प्रौद्योगिकी प्रतिलेखन और अन्य जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अत्यंत उपयोगी हो सकता है.
Introduction
ट्रांसक्रिप्शन, जो डीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके आरएनए अणुओं का उत्पादन करता है, जीन अभिव्यक्ति का पहला कदम है। जीवाणु आरएनए संश्लेषण आरएनए पॉलिमरेज (आरएनएपी) होलोएंजाइम के साथ लक्ष्य प्रवर्तक1,2 के लिए बंधन के बाद शुरू होताहै। आरएनएपी होलोएंजाइम (RNAPholo) में एक बहु-सबयूनिट उत्प्रेरक कोर (RNAPcore) और एक $ कारक शामिल है, जो प्रमोटर अनुक्रम को पहचानने के लिए आवश्यक है। ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर और दमनकारी, जिन्हें सामूहिक रूप से टीएफ कहा जाता है, आरएएनपीकोर के बाध्यकारी घटकों के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं, – कारक, और/या डीएनए। जीव पर निर्भर करता है, इसके जीनोम का एक महत्वपूर्ण हिस्सा TFs के लिए समर्पित किया जा सकता है कि शारीरिक जरूरतों और पर्यावरण संकेतों3के जवाब में प्रतिलेखन को विनियमित.
क्लैमिडिया एक अविकल्पी इंट्रासेल्यूलर जीवाणु है जो मनुष्यों और जानवरों में विभिन्न प्रकार के रोगों के लिए जिम्मेदारहै 4,5,6,7,8. उदाहरण के लिए, क्लैमिडिया ट्रैकोमैटिस यकीनन दुनिया भर में मनुष्यों में यौन संचारित रोगजनक संख्या है, और कुछ अविकसित देशों में अंधापन का एक प्रमुख कारण4,5. क्लैमिडिया में एक अद्वितीय विकास चक्र होता है जिसमें दो वैकल्पिक कोशिकीय रूप होते हैं जिन्हें प्राथमिक शरीर (ईबी) और रेटिकुलेट बॉडी (आरबी)9कहा जाता है। जबकि, ईबी एक extracellular वातावरण में जीवित रहने में सक्षम हैं, वे प्रसार में असमर्थ हैं. ईबीएस एंडोसाइटोसिस के माध्यम से मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं और संरोपण के बाद घंटों के भीतर मेजबान कोशिका द्रव्य में एक धानी में बड़े आरबी में अंतर करते हैं। अब संक्रामक, RBs द्विआधारी विखंडन के माध्यम से फैल. लगभग 20 एच, वे EBs, जो 30-70 एच के आसपास मेजबान कोशिकाओं से बाहर निकलने के लिए वापस अंतर करने के लिए शुरू करते हैं।
क्लैमिडियल विकास चक्र की प्रगति प्रतिलेखन द्वारा विनियमित की जाती है। जबकि लगभग 1,000 क्लैमिडियल जीनों का एक अति बहुमत मध्यचक्र के दौरान व्यक्त किया जाता है जिसके दौरान आरबीएस सक्रिय रूप से नकल कर रहे हैं, केवल एक छोटी संख्या में जीनों को मेजबान कोशिकाओं में ईबी के प्रवेश के तुरंत बाद टाइप किया जाता है ताकि रूपांतरण शुरू किया जा सके। आरबी में ईबी , और जीनों का एक अन्य छोटा सा सेट, आर बीएस 10,11में आरबी के विभेद को सक्षम करने के लिए प्रतिलेखन या तेजी से प्रतिलेखन किया जाता है .
क्लैमिडियल जीनोम तीन कारकों को एन्कोड करता है, अर्थात्र् 66, र्28 और र्54। ख्66, जो ई. कोलाई और अन्य बैक्टीरिया के 70 घर की रखवाली के बराबर है, प्रारंभिक और मध्य चक्र जीनों के प्रमोटरों के साथ-साथ कुछ देर से जीनों को पहचानने के लिए जिम्मेदार है, जबकि $28 और ख् 54 के लिए आवश्यक हैं कुछ देर जीन ों का प्रतिलेखन. अनेक जीनों में66पर निर्भर प्रवर्तक तथा28– निर्भर प्रवर्तक12दोनों को ले जाने के लिए जाना जाता है ।
एक जटिल विकास चक्र के बावजूद, क्लैमिडिया13में केवल कुछ ही संख्या में टीएफ पाए गए हैं। GrgA (पहले एक काल्पनिक प्रोटीन CT504 के रूप में सी trachomatis serovar डी और C. trachomatis L2 में CTL0766) एक क्लैमिडिया-विशिष्ट TF शुरू में66-निर्भर जीन14के एक उत्प्रेरक के रूप में मान्यता प्राप्त है . आत्मीयता pulldown परख का प्रदर्शन किया है कि GrgA दोनों बाध्यकारी द्वारा उनके प्रतिलेखन को सक्रिय करता है –66 और डीएनए. दिलचस्प है, यह बाद में पाया गया कि GrgA भी सह के साथ precipitates $28, और से प्रतिलेखन सक्रिय करता है –28– vitro मेंनिर्भर प्रमोटरों15. यह जाँचने के लिए कि क्या GrgA के समान या भिन्न सजातीयताएँ66 और $28के लिए हैं, हमने BLI का उपयोग करने का सहारा लिया। BLI परख से पता चला है कि GrgA के साथ सूचना का आदान-प्राप्त $66 एक 30 गुना अधिक आत्मीयता के साथ $28की तुलना में , सुझाव है कि GrgA में अंतर भूमिका निभा सकते हैं –66– निर्भर प्रतिलेखन और $28– निर्भर प्रतिलेखन 15.
बी एल आई सफेद प्रकाश के हस्तक्षेप पैटर्न का पता लगाता है जो बायोसेंसर की नोक पर स्थिर प्रोटीन की परत से प्रतिबिंबित होता है और इसकी तुलना आंतरिक संदर्भ परत16से करता है . इन दो हस्तक्षेप पैटर्न के विश्लेषण के माध्यम से, BLI biosensor की नोक करने के लिए बाध्य प्रोटीन की मात्रा के बारे में मूल्यवान और वास्तविक समय जानकारी प्रदान कर सकते हैं. प्रोटीन है कि biosensor की नोक करने के लिए स्थिर है ligand के रूप में जाना जाता है, और आम तौर पर एक आम एंटीबॉडी या epitope टैग की मदद से स्थिर है (उदाहरण के लिए, एक पाली-His- या biotin-टैग) है कि एक संबद्ध कण के लिए एक संबंध है (जैसे NTA या के रूप में Streptavidin) biosensor की नोक पर. एक माध्यमिक प्रोटीन की बाइंडिंग, analyte के रूप में जाना जाता है, biosensor की नोक पर ligand के साथ biosensor की अस्पष्टता में परिवर्तन बनाता है और इसलिए हस्तक्षेप पैटर्न में परिवर्तन में परिणाम. जब एनालाइट की विभिन्न सांद्रताओं पर दोहराया जाता है, तो बीएलआई न केवल गुणात्मक बल्कि लिगन्ड और एनालाइट16के बीच संबंध के बारे में मात्रात्मक जानकारी भी प्रदान कर सकता है।
हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हम पहली बार BLI को रोजगार के लिए प्रतिलेखन15में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की विशेषता थे. इस प्रकाशन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक GrgA टुकड़ा, जो पहले के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था $28-बाध्यकारी, वास्तव में बाइंडिंग मध्यस्थता. इस पांडुलिपि BLI assays के कदम पर केंद्रित है, और BLI रेखांकन और बाध्यकारी गतिज के मापदंडों के उत्पादन. लिगन्ड्स और एनालाइट्स के उत्पादन (और शुद्धिकरण) के लिए विधियाँ यहाँ शामिल नहीं हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन प्रोटीन बातचीत प्रतिलेखन और अन्य जैविक प्रक्रियाओं के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं. वे सबसे अधिक pulldown परख के माध्यम से अध्ययन कर रहे हैं. हालांकि pulldown परख अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए आसान क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान ] AI122034 और AI140167) और न्यू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन (ग्रेंट ] पीसी 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
