Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription
Summary
Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren (TFs) mit der RNA-Polymerase werden in der Regel mit Pulldown-Assays untersucht. Wir wenden eine Biolayer Interferometry (BLI) Technologie an, um die Wechselwirkung von GrgA mit der Chlamydien-RNA-Polymerase zu charakterisieren. Im Vergleich zu Pulldown-Assays erkennt BLI Echtzeit-Assoziation und Dissoziation, bietet eine höhere Empfindlichkeit und ist sehr quantitativ.
Abstract
Ein Transkriptionsfaktor (TF) ist ein Protein, das die Genexpression reguliert, indem es mit der RNA-Polymerase, einem anderen TF und/oder Schablonen-DNA interagiert. GrgA ist ein neuartiger Transkriptionsaktivator, der speziell im obligaten intrazellulären bakteriellen Erreger Chlamydien gefunden wurde. Protein-Pulldown-Assays mit Affinitätsperlen haben gezeigt, dass GrgA zwei Faktoren bindet, nämlich66 und28, die verschiedene Sätze von Promotoren für Gene erkennen, deren Produkte in Entwicklungsstadien unterschiedlich benötigt werden. Wir haben BLI verwendet, um die Interaktionen zu bestätigen und weiter zu charakterisieren. BLI zeigt mehrere Vorteile gegenüber Pulldown: 1) Es zeigt Echtzeit-Assoziation und Dissoziation zwischen Bindungspartnern, 2) Es erzeugt quantitative kinetische Parameter, und 3) Es kann Bindungen erkennen, die Pulldown-Assays oft nicht erkennen. Diese Eigenschaften haben es uns ermöglicht, die physiologischen Rollen von GrgA bei der Genexpressionsregulation in Chlamydienund mögliche detaillierte Wechselwirkungsmechanismen abzuleiten. Wir stellen uns vor, dass diese relativ erschwingliche Technologie äußerst nützlich für das Studium der Transkription und anderer biologischer Prozesse sein kann.
Introduction
Die Transkription, die RNA-Moleküle unter Verwendung von DNA als Vorlage produziert, ist der allererste Schritt der Genexpression. Die bakterielle RNA-Synthese beginnt nach der Bindung des RNA-Polymerase(RNAP)-Holoenzyms an einen Zielpromotor1,2. Das RNAP-Holoenzym (RNAPholo) besteht aus einem katalytischen Multi-Subunit-Kern (RNAPcore) und einem Faktor , der für die Erkennung der Promotorsequenz erforderlich ist. Transkriptionsaktivatoren und Repressoren, kollektiv tFs, regulieren die Genexpression durch die Bindungskomponenten des RNAPcore, Faktoren und/oder DNA. Je nach Organismus kann ein erheblicher Teil seines Genoms TFs gewidmet werden, die die Transkription als Reaktion auf physiologische Bedürfnisse und Umwelthinweise regulieren3.
Chlamydien ist ein obligat intrazelluläres Bakterium verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheiten bei Menschen und Tieren4,5,6,7,8. Zum Beispiel ist Chlamydia trachomatis wohl die Nummer eins sexuell übertragbarer Erreger beim Menschen weltweit und eine der Hauptursachen für Erblindung in einigen unterentwickelten Ländern4,5. Chlamydien hat einen einzigartigen Entwicklungszyklus gekennzeichnet durch zwei abwechselnde zelluläre Formen, die als Elementarkörper (EB) und Retikulatkörper (RB)9bezeichnet werden. Während EBs in einer extrazellulären Umgebung überleben können, sind sie nicht in der Lage, sich zu vermehren. EBs gelangen durch Endozytose in Wirtszellen und differenzieren sich innerhalb weniger Stunden nach der Inokulation in größere RBs in einer Vakuole im Wirtszytoplasma. Nicht mehr infektiös, RBs vermehren sich durch binäre Spaltung. Gegen 20 h beginnen sie sich wieder zu den EBs zu differenzieren, die die Wirtszellen um 30-70 h verlassen.
Das Fortschreiten des Chlamydien-Entwicklungszyklus wird durch Transkription reguliert. Während während des Midzyklus, in dem sich RBs aktiv replizieren, eine Übermehrheit der fast 1.000 Chlamydiengene exprimiert wird, wird nur eine kleine Anzahl von Genen unmittelbar nach dem Eintritt von EBs in die Wirtszellen transkribiert, um die Umwandlung von EBs in RBs, und ein weiterer kleiner Satz von Genen werden transkribiert oder zunehmend transkribiert, um die Differenzierung von RBs in EBs10,11zu ermöglichen.
Das Chlamydien-Genom kodiert drei Faktoren, nämlich66,28 und54. 66, was der Haushaltsführung von E. coli und anderen Bakterien entspricht, ist für die Erkennung von Promotoren von Frühen- und Midcycle-Genen sowie einiger später Gene verantwortlich, währendfür die transkription bestimmter später Gene. Es ist bekannt, dassmehrere Gene sowohl einen -66-abhängigen Promotor als auch einen 28-abhängigen Promotor12tragen.
Trotz eines komplizierten Entwicklungszyklus wurde nur eine geringe Anzahl von TFs in Chlamydiengefunden 13. GrgA (früher als hypothetisches Protein CT504 in C. trachomatis serovar D und CTL0766 in C. trachomatis L2) ist ein Chlamydien-spezifischerTF, der ursprünglich als Aktivator von66-abhängigen Genen14anerkannt wurde. Affinity Pulldown-Assays haben gezeigt, dass GrgA ihre Transkription aktiviert, indem sie sowohl66 € als auch DNA bindet. Interessanterweise wurde später festgestellt, dass GrgA auch mit28, und aktiviert Transkription von28-abhängigen Promotoren in vitro15. Um zu untersuchen, ob GrgA ähnliche oder unterschiedliche Affinitäten für66 und28€ hat, haben wir auf die Verwendung von BLI zurückgegriffen. BLI-Assays haben gezeigt, dass GrgA mit einer 30-fach höheren Affinität als mit28000 Personen interagiert, was darauf hindeutet, dass GrgA unterschiedliche Rollen in der -66-abhängigen Transkription und der28-abhängigenTranskription spielen kann. 15.
BLI erkennt das Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Schicht immobilisierten Proteins an der Spitze eines Biosensors reflektiert wird, und vergleicht es mit dem einer internen Referenzschicht16. Durch die Analyse dieser beiden Interferenzmuster kann BLI wertvolle und Echtzeitinformationen über die Menge an Protein liefern, die an die Spitze des Biosensors gebunden ist. Das Protein, das bis zur Spitze des Biosensors immobilisiert ist, wird als Liganden bezeichnet und in der Regel mit Hilfe eines gemeinsamen Antikörpers oder Epitop-Tags (z. B. einem Poly-His- oder Biotin-Tag) immobilisiert, das eine Affinität zu einem assoziierten Teilchen (wie NTA oder Streptavidin) auf der Spitze des Biosensors. Die Bindung eines Sekundärproteins, das als Analyt bezeichnet wird, mit dem Liganden an der Spitze des Biosensors führt zu Veränderungen in der Deckkraft des Biosensors und führt somit zu Veränderungen der Interferenzmuster. Bei wiederholter Konzentration verschiedener Konzentrationen des Analyten kann BLI nicht nur qualitative, sondern auch quantitative Informationen über die Affinität zwischen Liganden und Analyt16liefern.
Nach bestem Wissen und Gewissen waren wir die ersten, die BLI einsetzten, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Transkription15zu charakterisieren. In dieser Publikation zeigen wir, dass ein GrgA-Fragment, das zuvor für die Bindung von28€ erforderlich war, die Bindung tatsächlich vermittelt. Dieses Manuskript konzentriert sich auf Schritte der BLI-Assays und die Generierung von BLI-Diagrammen und Parametern der Bindungskinetik. Methoden zur Herstellung (und Reinigung) von Liganden und Analyten werden hier nicht behandelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind entscheidend für die Regulierung der Transkription und anderer biologischer Prozesse. Sie werden am häufigsten durch Pulldown-Assays untersucht. Obwohl Pulldown-Assays relativ einfach durchzuführen sind, sind sie schlecht quantitativ und können schwache, aber biologisch sinnvolle Wechselwirkungen möglicherweise nicht erkennen. Im Vergleich dazu bietet BLI durch die Erkennung von Echtzeitassoziation und Dissoziation zwischen einem Liganden und einem Analyten Assoziations- und Dis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Grants AI122034 und AI140167) und der New Jersey Health Foundation (Grant- PC 20-18) unterstützt.
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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