Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie
Summary
Interacties van transcriptiefactoren (TFs) met de RNA-polymerase worden meestal bestudeerd met behulp van keuze assays. We passen een Biolayer interferometrie (BLI) technologie toe om de interactie van GrgA met de chlamydiale RNA-polymerase te karakteriseren. Vergeleken met keuze assays, bli detecteert real-time associatie en dissociatie, biedt een hogere gevoeligheid, en is zeer kwantitatief.
Abstract
Een transcriptiefactor (TF) is een eiwit dat de genexpressie reguleert door interactie met de RNA-polymerase, een andere TF-en/of template-DNA. Grga is een roman transcriptie Activator die specifiek is gevonden in de verplicht intracellulaire bacteriële pathogeen chlamydia. Eiwit keuze assays met behulp van affiniteits kralen hebben aangetoond dat grga bindt twee σ factoren, namelijk σ66 en σ28, die verschillende sets van promoters voor genen waarvan de producten zijn differentieel vereist in ontwikkelingsstadia te erkennen. We hebben BLI gebruikt om de interacties te bevestigen en verder te karakteriseren. Bli toont verschillende voordelen ten opzichte van keuze: 1) het onthult real-time associatie en dissociatie tussen bindende partners, 2) het genereert kwantitatieve kinetische parameters, en 3) het kan bindingen detecteren die keuze assays vaak niet detecteren. Deze kenmerken hebben ons in staat gemaakt om de fysiologische rollen van GrgA in genexpressie regulering in Chlamydiaen mogelijke gedetailleerde interactie mechanismen te afleiden. We voor ogen dat deze relatief betaalbare technologie kan zeer nuttig zijn voor het bestuderen van transcriptie en andere biologische processen.
Introduction
Transcriptie, die RNA moleculen produceert met behulp van DNA als template, is de allereerste stap van genexpressie. Bacteriële RNA-synthese begint na de binding van het RNA polymerase (rnap) holoenzym aan een doel promotor1,2. Het RNAP-holoenzym (RNAPholo) bestaat uit een katalytische kern met meerdere subeenheden (RNAPcore) en een σ-factor, die nodig is voor het herkennen van de volgorde van de organisator. Transcriptie Activators en repressors, gezamenlijk genoemd TFs, reguleren de genexpressie door de bindende componenten van de RNAPcore, σ factoren, en/of DNA. Afhankelijk van het organisme kan een aanzienlijk deel van het genoom worden gewijd aan TFs die transcriptie reguleren in reactie op fysiologische behoeften en omgevings aanwijzingen3.
Chlamydia is een verplicht intracellulaire bacterie die verantwoordelijk is voor een verscheidenheid aan ziekten bij mensen en dieren4,5,6,7,8. Chlamydia trachomatis is bijvoorbeeld aantoonbaar het nummer één seksueel overdraagbare pathogeen bij mensenwereld wijd, en een leidende oorzaak van blindheid in sommige onderontwikkelde landen4,5. Chlamydia heeft een unieke ontwikkelingscyclus die wordt gekenmerkt door twee alternerende cellulaire vormen die het elementaire lichaam (EB) en Reticulate Body (RB)9worden genoemd. Terwijl EBs in een extracellulaire omgeving kan overleven, zijn ze niet in staat tot proliferatie. EBs Voer cellen in door middel van endocytose en differentiëren in grotere RBs in een vacuole in het host cytoplasma binnen uur na inoculatie. Niet langer infectieuze, RBs prolifereren door binaire splijting. Rond 20 h, ze beginnen te differentiëren terug naar de EBs, die de gastheer cellen rond 30-70 h verlaten.
Progressie van de chlamydiale ontwikkelingscyclus wordt gereguleerd door transcriptie. Overwegende dat een overgrote meerderheid van de bijna 1.000 chlamydiale genen wordt uitgedrukt tijdens de midcyclus waarin RBs actief repliceert, slechts een klein aantal genen wordt direct na de invoer van EBs in de gastheer cellen getranscribeerd om de omzetting van EBs in RBs, en een andere kleine reeks genen worden getranscribeerd of steeds getranscribeerd om de differentiatie van RBs in EBs10,11mogelijk te maken.
Het chlamydiale genoom codeert drie σ-factoren, namelijk σ66, σ28 en σ54. σ66, die gelijkwaardig is aan de huishoudservice σ70 van E. coli en andere bacteriën, is verantwoordelijk voor het herkennen van promotors van vroege en mid-Cycle genen en sommige late genen, terwijl σ28 en σ54 nodig zijn voor de transcriptie van bepaalde late genen. Er zijn verschillende genen waarvan bekend is dat ze zowel een σ66-afhankelijke promotor als een σ28-afhankelijke promotor12dragen.
Ondanks een ingewikkelde ontwikkelingscyclus is er slechts een klein aantal TFs gevonden in Chlamydiae13. GrgA (eerder geannoleerd als een hypothetisch proteïne CT504 in c. trachomatis Serovar D en CTL0766 in c. trachomatis L2) is een Chlamydia-specifieke TF die aanvankelijk wordt herkend als een activator van σ66-afhankelijke genen14. Affiniteit keuze assays hebben aangetoond dat grga hun transcriptie activeert door zowel σ66 als DNA te binden. Interessant is dat het later werd gevonden met die GrgA ook co-precipiteert met σ28, en activeert transcriptie van σ28-afhankelijke promotors in vitro15. Om te onderzoeken of GrgA vergelijkbare of verschillende affiniteiten heeft voor σ66 en σ28, hebben we gebruik gemaakt van bli. BLI assays hebben aangetoond dat GrgA samenwerkt met σ66 met een 30-voudige hogere affiniteit dan met σ28, wat suggereert dat grga differentiële rollen kan spelen in σ66-afhankelijke transcriptie en σ28-afhankelijke transcriptie 15.
BLI detecteert het interferentiepatroon van wit licht dat reflecteert van een laag geïmmobiliseerd eiwit op de punt van een biosensor en vergelijkt het met die van een interne referentielaag16. Door de analyse van deze twee interferentie patronen kan BLI waardevolle en real-time informatie verschaffen over de hoeveelheid eiwit gebonden aan de punt van de biosensor. Het eiwit dat wordt geïmmobiliseerd tot de punt van de biosensor wordt aangeduid als de ligand, en is over het algemeen geïmmobiliseerd met behulp van een gemeenschappelijk antilichaam of epitoop tag (bijvoorbeeld, een poly-his-of Biotine-tag) die affiniteit heeft voor een bijbehorend deeltje (zoals NTA of Streptavidine) op de punt van de biosensor. De binding van een secundair eiwit, aangeduid als de analyt, met de ligand aan de punt van de biosensor creëert veranderingen in de ondoorzichtigheid van de biosensor en resulteert daarom in veranderingen in interferentie patronen. Indien herhaald over verschillende concentraties van de analyt, kan BLI niet alleen kwalitatieve, maar ook kwantitatieve informatie verschaffen over de affiniteit tussen de ligand en de analyt16.
Naar het beste van onze kennis, waren we de eersten die BLI gebruiken om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren in transcriptie15. In deze publicatie tonen we aan dat een GrgA-fragment, dat voorheen vereist was voor σ28-binding, inderdaad de binding bemiddelt. Dit manuscript richt zich op stappen van de BLI-assays en het genereren van BLI-grafieken en parameters van bindende kinetiek. Methoden voor de productie (en zuivering) van liganden en analyten worden hier niet behandeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eiwit-eiwit interacties zijn cruciaal voor de regulering van transcriptie en andere biologische processen. Ze worden meestal bestudeerd via keuze assays. Hoewel keuze assays relatief eenvoudig uit te voeren zijn, zijn ze slecht kwantitatief en kunnen ze zwakke maar biologisch zinvolle interacties niet detecteren. In vergelijking, door het detecteren van real-time associatie en dissociatie tussen een ligand en een analyt, biedt BLI associatie-en dissociatie percentage constanten, evenals, algemene affiniteit.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door National Institutes of Health (subsidies # AI122034 en AI140167) en New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
