전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용
Summary
RNA 중합효소와의 전사 인자 (TFs)의 상호 작용은 일반적으로 풀다운 검정을 사용하여 연구됩니다. 우리는 클라미다이얼 RNA 폴리머라제와 GrgA의 상호 작용을 특성화하기 위해 생체층 간섭측정기(BLI) 기술을 적용합니다. 풀다운 분석과 비교하여 BLI는 실시간 연결 및 해리를 감지하고 더 높은 감도를 제공하며 정량적입니다.
Abstract
전사 인자 (TF)는 RNA 폴리머라제, 다른 TF 및 / 또는 템플릿 DNA와 상호 작용하여 유전자 발현을 조절하는 단백질입니다. GrgA는 의무적인 세포내 세균성 병원체 클라미디아에서 특별히 발견되는 새로운 전사 활성제이다. 친화성 구슬을 이용한 단백질 풀다운 분석제는 GrgA가 발달 단계에서 제품이 차별화적으로 요구되는 유전자에 대한 프로모터의 다른 세트를 인식하는 두 가지 σ 인자, 즉 σ66 및 σ28을결합한다는 것을 밝혀냈습니다. 우리는 BLI를 사용하여 상호 작용을 확인하고 더 특성화했습니다. BLI는 풀다운에 비해 몇 가지 장점을 보여줍니다: 1) 결합 파트너 간의 실시간 연관 및 해리를 드러내고, 2) 정량적 운동 파라미터를 생성하고, 3) 풀다운 분석이 종종 검출하지 못하는 바인딩을 검출할 수 있다. 이러한 특성은 클라미디아에서유전자 발현 조절에서 GrgA의 생리적 역할을 추론할 수 있게 해주었으며, 가능한 상세한 상호작용 메커니즘을 가능하게 한다. 우리는 이 상대적으로 저렴한 기술이 전사 및 기타 생물학적 과정을 연구하는 데 매우 유용할 수 있다고 생각합니다.
Introduction
DNA를 템플릿으로 사용하여 RNA 분자를 생성하는 전사는 유전자 발현의 첫 번째 단계입니다. 세균성 RNA 합성은 표적 프로모터1,2에RNA 중합효소(RNAP) 홀로효소의 결합에 따라 시작된다. RNAP 홀로효소(RNAPholo)는 프로모터 서열을 인식하기 위해 요구되는 다중 서브유닛 촉매 코어(RNAPcore) 및 σ 인자로 구성된다. 전사 활성제 및 억압자, 집합적으로 TFs라고 불리는, RNAPcore, σ 인자 및/또는 DNA의 결합 분대를 통해 유전자 발현을 조절합니다. 유기체에 따라, 그 게놈의 상당 부분은 생리적 필요 및 환경 단서3에 응하여전사를 조절하는 TFs에 전념될 수 있다.
클라미디아는 인간과 동물의 다양한 질병에 대한 책임이 있는 의무적인 세포내세균입니다 4, 5,6,7,8. 예를 들면, 클라미디아 trachomatis는 틀림없이 세계적인 인간에 있는 제 1 의 성병전달병원체이고,몇몇 저개발 국가에서 실명의 주요한 원인 4,5. 클라미디아는 초등체(EB) 및 망상체(RB) 9라고 불리는 두 개의 교대세포 형태를 특징으로하는 독특한 발달 주기를 가지고 있다. 반면, EB는 세포 외 환경에서 생존 할 수 있지만, 그들은 증식 할 수 없습니다. EBs는 내분비증을 통해 숙주 세포를 입력하고 접종 후 시간 이내에 숙주 세포질에서 더 큰 RBs로 분화합니다. 더 이상 전염성이 없는, RBs는 이진 분열을 통해 증식합니다. 약 20 시간, 그(것)들은 30-70 시간의 주위에 호스트 세포를 종료하는 EBs로 다시 분화하기 시작합니다.
클라미다이얼 발달 주기의 진행은 전사에 의해 조절된다. 거의 1,000개의 클라미다이얼 유전자의 과반수가 RBs가 활발하게 복제되는 중주기 동안 발현되는 반면, 소수의 유전자만이 EB를 숙주 세포로 입력한 직후에 전사되어 렙스내로의 EBs, 및 또 다른 작은 유전자 세트는 BBs10,11로의 RBs의 분화를 가능하게 하기 위하여 전사되거나 점점 전사된다.
클라미다이얼 게놈은 세 가지 σ 인자, 즉 σ66,σ28 및 σ54를인코딩합니다. σ66은 대장균 및 기타 박테리아의 하우스키핑 σ70과 동등한 것으로, 초기 및 중간 주기 유전자뿐만 아니라 일부 후기 유전자의 프로모터를 인식하는 역할을 하는 반면 σ28 및 σ54는 필요합니다. 특정 후기 유전자의 전사. 여러 유전자는 σ 66-의존성 프로모터 및 σ28-의존성프로모터(12)를 모두 운반하는 것으로 알려져 있다.
복잡한 발달 주기에도 불구하고 클라미디아13에서소수의 F만 발견되었습니다. GrgA(이전에는 C. 트라코마티스 세로바르 D 및 CTL0766에서 C. 트라코마티스 혈청Var D 및 CTL0766에서 가상 단백질 CT504로 주석을 주석화) 클라미디아-특이적TF는 처음에 σ 66-의존성 유전자(14)의 활성제로 인식되었다. 친화성 풀다운 검사는 GrgA가 σ66 및 DNA를 결합시킴으로써 그들의 전사를 활성화한다는 것을 입증했다. 흥미롭게도, 나중에 GrgA가 σ28과병동침을 가하고, σ28-의존적프로모터로부터 의 전사를 시험관내15로활성화한다는 것을 나중에 발견되었다. GrgA가 σ66 및 σ28에대해 유사하거나 상이한 친화력을 가지고 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 BLI를 사용하는 데 의존했다. BLI 어설슬보에 따르면 GrgA는 σ 28보다 30배 더 높은친화도에서 σ66과 상호 작용하는 것으로 나타났으며, 이는 GrgA가 σ 66-의존적 전사 및 σ28-의존적전사에서 차등 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 15.
BLI는 바이오센서의 끝부분에 있는 고정화 단백질 층으로부터 반사되는 백색광의 간섭 패턴을 검출하고 이를 내부기준층(16)의 것과 비교한다. BLI는 이러한 두 가지 간섭 패턴을 분석하여 바이오센서의 팁에 결합된 단백질의 양에 대한 귀중하고 실시간 정보를 제공할 수 있습니다. 바이오센서의 팁에 고정되는 단백질은 리간드라고 하며, 일반적으로 NTA 또는 관련 입자에 대한 친화도를 가지는 일반적인 항체 또는 에피토프 태그(예를 들어, 폴리-His-또는 비오틴 태그)의 도움으로 고정화된다. 스트렙타비딘)을 바이오센서 의 끝에. 분석물로 불리는 이차 단백질의 결합은 바이오센서의 끝에 있는 리간드가 바이오센서의 불투명도에 변화를 일으켜 간섭 패턴의 변화를 초래합니다. 분석물의 상이한 농도에 걸쳐 반복될 때, BLI는 질적뿐만 아니라 리간드와 분석액(16)사이의 친화성에 대한 정량적 정보를 제공할 수 있다.
우리의 지식의 베스트에, 우리는 전사15에있는 단백질 단백질 상호 작용을 특성화하기 위하여 BLI를 채택한 첫번째이었습니다. 본 공보에서는 σ 28-바인딩에 대해 이전에 요구되었던GrgA 프래그먼트가 실제로 바인딩을 중재한다는 것을 보여 줍니다. 이 원고는 BLI 분석의 단계, 그리고 BLI 그래프의 생성및 결합 역학의 파라미터에 초점을 맞추고 있습니다. 리간드 및 타말수의 생산 (및 정제)을위한 방법은 여기에서 다루지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 단백질 상호 작용은 전사 및 기타 생물학적 과정의 조절에 매우 중요합니다. 그(것)들은 풀다운 assays를 통해 일반적으로 공부됩니다. 풀다운 분석은 상대적으로 수행하기 쉽지만 양이 적고 약하지만 생물학적으로 의미있는 상호 작용을 감지하지 못할 수 있습니다. 이에 비해, 리간드와 어말레이트 사이의 실시간 연관 및 해리를 검출함으로써 BLI는 협회 및 해리속도 상수뿐만 아니라 전반?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국가 학회 (보조금 # AI122034 및 AI140167)와 뉴저지 건강 재단 (보조금 # PC 20-18)에 의해 지원되었다.
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
