Summary

بالموجات فوق الصوتية زيادة الابتدائية الكبار العزلة الليفية

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الليفية للبالغين في المرحلة الابتدائية بطريقة سهلة وسريعة وموثوق بها، يمكن تنفيذها من قبل المبتدئين (على سبيل المثال، الطلاب). يجمع الإجراء بين هضم الأنسجة الأنزيمية والهياج الميكانيكي مع الموجات فوق الصوتية للحصول على الخلايا الليفية الأولية. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع متطلبات تجريبية محددة (مثل الأنسجة البشرية).

Abstract

أصبحت الخلايا الليفية الأولية للبالغين أداة هامة لدراسة التليف والتفاعلات الليفية والالتهاب في جميع أنسجة الجسم. وبما أن الخلايا الليفية الأولية لا يمكن أن تقسم إلى أجل غير مسمى بسبب تمايز myofibroblast أو تحريض الحساسية، يجب إنشاء ثقافات جديدة بانتظام. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات التي يجب التغلب عليها خلال عمليات وضع بروتوكول عزل موثوق بها والعزلة الليفية الأولية نفسها: درجة صعوبة الأسلوب (وخاصة للمبتدئين)، وخطر التلوث البكتيري، و الوقت المطلوب حتى يمكن استخدام الخلايا الليفية الأولية للتجارب، ونوعية الخلايا اللاحقة وصلاحيتها. في هذه الدراسة، يتم توفير بروتوكول سريع وموثوق به وسهل التعلم لعزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية للبالغين من قلب الماوس والرئة والكبد والكلى التي تجمع بين الهضم الأنزيمي والهياج بالموجات فوق الصوتية.

Introduction

الخلايا الليفية هي خلايا مسطحة على شكل مغزل مع عمليات ستيلات متعددة وreticulum endoplasmic واسعة النطاق1،2. متوسط قياس الليفية 30 – 100 ميكرومتر ولها مدىالحياة من 57 ± 3 أيام 1،3. متوسط مدة دورة الخلية من الخلايا الليفية البشرية تتراوح بين 16 – 48 ساعة اعتمادا على ظروف الثقافة4. هناك أدلة على أن القدرة المستنسخة والجودة الوظيفية للفليائيات الأولية المستزرعة ترتبط سلبا مع سن المانحين، مما يشير إلى أنه ينبغي تفضيل المانحين الأصغر سنا (الحيوانات أو المرضى) إذا كان ذلك ممكنا5و6 .

تشكل الخلايا الليفية نوع الخلية السائد لمعظم أنسجة الجسم الثدييات. على الرغم من وجودها في كل مكان، وتحديد الجزيئية من الخلايا الليفية لا يزال تحديا7. تنتقل الخلايا الليفية إلى تطوير الأنسجة والأعضاء من مصادر مختلفة أثناء النمو الجنيني8. لهذا السبب، هناك عدد كبير من البروتينات علامة التي يمكن العثور عليها في الخلايا الليفية في حين أن البروتينات علامة فريدة من نوعها، والتي هي موجودة في كل السكان الأورام الليفية والحصرية للفليّة، لا تزال مفقودة. وهكذا، عادة ما تستخدم أنماط التعبير من عدة علامات معترف بها لتحديد الخلايا الليفية. من بين العلامات الأكثر شهرة هي فيمنتين، بروتين سطح الليفية البشرية (hFSP)، مستقبلات المجال المديسكوين 2 (DDR2) وألفا الأكتين العضلات الملساء (αSMA).

الخلايا الليفية هي المصفوفة الرئيسية خارج الخلية (ECM) المنتجة لنوع الخلية. وبالتالي، فإن الخلايا الليفية تحافظ علىبنية الأنسجة المنظمة وتوفر الدعم الميكانيكي للخلايا المجاورة 1. التوازن بين توليف إدارة المحتوى في المؤسسة والتدهور هو عملية منظمة تنظيماجيدا. التحولات نحو التوليف علامة على بداية الترسيب ECM المفرطالذي، إذا لم يتم إنهاؤه، يؤدي إلى التليف. يتم التوسط في التليف من قبل myofibroblasts، والتي تنشأ من الخلايا الليفية المنشطة التي تمر التغيرات الجزيئية والفيلونمطية. إحدى السمات المميزة للمقلبين هو تعزيز إفراز ECM والسيتوكينات والتعبير عن خيوط αSMA الدقيقة مرتبة بشكل منظم9.

وقد تم الخلايا الليفية الأولية في دائرة الضوء على البحوث الأخيرة التي تركز على التليف, التهاب الأنسجة والتفاعلات الليفية السرطان الخلية10,11. ومع ذلك، لدراسة فعالة خصائص الخلايا الليفية في الصحة والمرض، فمن الضروري لعزل الخلايا الليفية الأولية القابلة للحياة الكبار على أساس منتظم. هناك العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الليفية12،13،14. الطرق الرئيسية الثلاثة لعزل الليفية هي النمو من قطع الأنسجة12، هضم الأنسجة الأنزيمية15، والتسريب الأنزيمي للأعضاء جوفاء9،13،16. ميزة النمو هو عملية عزل لطيف دون تدهور الخلايا الأنزيمية. ومن ناحية أخرى، عادة ما تتطلب ثقافات النمو فترات ثقافية مطولة حتى يمكن استخدام الخلايا للتجارب. الهضم الأنزيمي الشائع سريع ولكنه يحمل خطر التلوث مع أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، الخلايا البطانية) أو البكتيريا في عملية التحريض، وهو أمر ضروري لحل الأنسجة ميكانيكيا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون مفصلة وتتطلب وقتا ومهارة للتعلم.

وفيما يتعلق بأهمية الخلايا الليفية الأولية في البحوث، لا تزال هناك حاجة إلى تحسين نُهج عزل الخلايا القائمة من حيث السرعة والبساطة والموثوقية. هنا، يتم توفير طريقة جديدة العزل الأورام الليفية الأنزيمية المستندة إلى الموجات فوق الصوتية تقديم خلايا عالية الجودة.

Protocol

يتبع البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات من جامعة دريسدن التقنية، ألمانيا (رقم الملف: T 2014/4) وكذلك المبادئ التوجيهية المقبولة دوليا لرعاية الحيوانات (FELASA)17. يصور الشكل 1 عملية عزل الخلية. 1. إعداد الإعداد والمواد ووسائل ?…

Representative Results

وقد ثبت قدرة هذا البروتوكول على عزل الخلايا الليفية للبالغين من أنسجة المورين الصلبة. تم الحصول على الخلايا الليفية القابلة للحياة التي يمكن استخدامها للتجارب اللاحقة مثل تلطيخ المناعة أو تجارب الانتشار (الشكل2D-F، الشكل 5A). <p class="jove_conten…

Discussion

بالمقارنة مع خطوط الخلايا الليفية الخالدة، تقدم الخلايا الليفية الأولية العديد من المزايا. ويمكن عزلها من حيث التكلفة بشكل فعال في نوعية عالية وكمية. وعلاوة على ذلك، توفر الثقافات الأولية إمكانية دراسة الخلايا من أفراد متعددين، مما يزيد من موثوقية النتائج التي تم الحصول عليها ويقلل من ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر السيدة رومي كيمب والسيدة أنيت أوبيتز على الدعم التقني الخبير. كما نشكر السيد بيورن بينينغ على دعمه في تكنولوجيا المعلومات. تم دعم هذا العمل بمنح من (أ) كلية الطب كارل غوستاف غوستاف (كاروس دريسدن) ونحن ممتنون للتمويل والدعم.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 ml
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

References

  1. Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
  2. Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
  3. Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
  4. Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
  5. Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
  6. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
  7. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  8. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  9. Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
  10. Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
  11. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  12. Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
  13. Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  14. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
  15. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  16. El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
  17. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
  18. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
  19. Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
  20. Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
  21. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed – NCBI Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019)
  22. Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  23. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
  24. Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
  25. Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
check_url/59858?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

View Video