Ultrasonik-Augmented primer yetişkin fibroblast yalıtım
Summary
Birincil erişkin fibroblastları, yeni başlayanlar tarafından (örn. öğrenciler) kolay, hızlı ve güvenilir bir şekilde ayırmak için bir protokol sunuyoruz. Prosedür primer fibroblastlar elde etmek için enzimatik doku sindirim ve ultrasonik dalgalar ile mekanik ajitasyon birleştirir. Protokol, belirli deneysel gereksinimlere (örn. insan dokusu) kolayca adapte edilebilir.
Abstract
Primer erişkin fibroblastlar tüm vücut dokularında fibrozis, fibroblast etkileşimleri ve inflamasyonu incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Primer fibroblastlar myofibroblast farklılaşma veya senesans indüksiyon nedeniyle sonsuza kadar bölünemez beri, yeni kültürler düzenli olarak kurulmalıdır. Ancak, güvenilir bir yalıtım Protokolü ve primer fibroblast yalıtım kendisi geliştirme süreçleri sırasında üstesinden gelmek için birkaç engel vardır: zorluk yöntemin derecesi (özellikle yeni başlayanlar için), bakteriyel kontaminasyon riski, Primer fibroblastlar deneyler için kullanılabilir ve sonraki hücre kalitesi ve viability kadar gerekli zaman. Bu çalışmada, hızlı, güvenilir ve öğrenme kolay bir protokol izole etmek ve kültür birincil yetişkin fibroblastlar fare kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek enzimatik sindirim ve ultrasonik ajitasyon birleştiren sağlanır.
Introduction
Fibroblastlar, birden fazla stellat süreçleri ve geniş bir kaba endoplazmik retikulum ile düz, iğ şeklinde hücreler1,2. Ortalama bir fibroblast 30-100 μm ölçer ve 57 ± 3 gün1,3yaşam süresi vardır. İnsan fibroblastlarının ortalama hücre döngüsü süresi, kültür koşullarına göre 16-48 h arasında değişmektedir4. Kültürlü primer fibroblastların çoğaltılabilir kapasitesinin ve fonksiyonel kalitesinin, donör çağıyla olumsuz şekilde ilişkilendirileceğinden, Genç bağışçıların (hayvanların veya hastaların) mümkünse5,6 .
Fibroblastlar en memeli vücut dokularının baskın bir hücre türünü oluşturmaktadır. Her zaman bulundukları varlığa rağmen, fibroblastların moleküler tanımlaması hala bir zorluk7. Fibroblastlar, embriyonik gelişim sırasında farklı kaynaklardan gelen doku ve organlara göç etmek8. Bu nedenle, fibroblastlar içinde bulunan, her fibroblast nüfusunda bulunan ve fibroblastların özel olan benzersiz Marker proteinlerinin hala eksik olduğu bir bolluk Marker proteini vardır. Böylece, birçok tanınan işaretçileri ifade desenleri genellikle fibroblastlar tanımlamak için kullanılır. En tanınmış belirteçleri arasında vimentin, insan fibroblast yüzey proteini (hFSP), discoidin Domain reseptör 2 (DDR2) ve Alfa pürüzsüz Kas aksini (αSMA).
Fibroblastlar, büyük hücre içi matris (ECM) üreten hücreli tiptir. Böylece, fibroblastlar düzenli bir doku mimarisi korumak ve komşu hücreler için mekanik destek sağlamak1. ECM sentezi ile bozulma arasındaki denge iyi düzenlenmiş bir süreçtir. Sentez yönüne doğru vardiyalar, sonlandırılmadıkça fibrozis yol açan aşırı ECM birikmesi başlangıcına işaret ederler. Fibrozis, moleküler ve fenotektal değişikliklerden kaynaklanan aktif fibroblastlar kaynaklı myofibroblastlar tarafından aracılılar. Miyofibroblastların bir damgasını ECM ve sitokinlerin salgılanması ve düzenli olarak düzenlenmiş αSMA mikrofilemlerin ifadesi9.
Primer fibroblastlar, fibrozis, doku iltihabı ve fibroblast-kanser-hücre etkileşimlerine odaklanan son araştırmaların Spotlight olduğunu10,11. Ancak, sağlık ve hastalık fibroblast özellikleri etkili bir şekilde çalışmak için, düzenli olarak uygun primer erişkin fibroblastlar izole etmek gereklidir. Fibroblastlar12,13,14yalıtmak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fibroblast izolasyonunun üç ana yöntemi, doku parçaları12, enzimatik doku sindirimi15ve boş organların enzimatik perfüzyon9,13,16büyüme vardır. Büyüme avantajı enzimatik hücre bozulması olmadan nazik bir yalıtım sürecidir. Öte yandan, büyüme kültürler genellikle hücreler deneyler için kullanılabilir kadar uzun süreli kültür dönemleri gerektirir. Yaygın enzimatik sindirim hızlı ama diğer hücre türleri ile kontaminasyon riski taşımaktadır (örneğin, endotel hücreleri) veya bakteri ajitasyon sürecinde, hangi mekanik doku çözülür için gerekli olan. Ayrıca, bu yöntemler genellikle ayrıntılı ve öğrenmek için zaman ve beceri gerektirir.
Araştırmalarda primer fibroblastların önemi ile ilgili olarak, mevcut hücre yalıtım yaklaşımlarını hızlı, basitlik ve güvenilirlik açısından optimize etmek için hala bir ihtiyaç vardır. Burada, yüksek kaliteli hücreler sunan bir yeni ultrasonik bazlı enzimatik fibroblast yalıtım yöntemi sağlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mortalize fibroblast hücre hatları ile karşılaştırıldığında, primer fibroblastlar çeşitli avantajlar sunar. Yüksek kalitede ve miktarda verimli bir şekilde maliyet yalıtılabilir. Ayrıca, primer kültürler, elde edilen sonuçların güvenilirliğini artıran ve sadece hücre kültürü eserlerinin incelenmesi olasılığını azaltan birden fazla kişiden hücre Etüdü olanağı sunar. Yeni primer kültürlerin sürekli üretimi, tekrarlanan geçişte21‘ den sonra sıklıkla meyd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz uzman teknik destek için Bayan Romy Kempe ve Bayan Annett Opitz teşekkür ederiz. Biz de destek için Bay Bjoern Binnewerg teşekkür ederiz. Bu iş bir) tarafından destekleniyordu a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) “Habilitationsförderprogramm für Frauen”, Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden ve c) başka Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Tıp Fakültesi Carl Gustav Carus Dresden. Biz fon ve destek için minnettarız.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
References
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed – NCBI Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019)
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
