Isolement du fibroblaste primaire adulte à ultrasons
Summary
Nous présentons un protocole pour isoler les fibroblastes adultes primaires d’une manière facile, rapide et fiable, performable par les débutants (p. ex., les étudiants). La procédure combine la digestion des tissus enzymatiques et l’agitation mécanique avec des ondes ultrasoniques pour obtenir des fibroblastes primaires. Le protocole peut facilement être adapté à des exigences expérimentales spécifiques (p. ex., tissus humains).
Abstract
Les fibroblastes adultes primaires sont devenus un outil important pour étudier la fibrose, les interactions de fibroblaste et l’inflammation dans tous les tissus du corps. Puisque les fibroblastes primaires ne peuvent pas se diviser indéfiniment en raison de la différenciation ou de l’induction de la sénescence myofibroblaste, de nouvelles cultures doivent être établies régulièrement. Cependant, il y a plusieurs obstacles à surmonter au cours des processus de développement d’un protocole d’isolement fiable et d’isolement primaire du fibroblaste lui-même : le degré de difficulté de la méthode (surtout pour les débutants), le risque de contamination bactérienne, le temps nécessaire jusqu’à ce que les fibroblastes primaires puissent être utilisés pour des expériences, et la qualité et la viabilité cellulaires subséquentes. Dans cette étude, un protocole rapide, fiable et facile à apprendre pour isoler et culture les fibroblastes adultes primaires du cœur de souris, du poumon, du foie et du rein combinant digestion enzymatique et agitation ultrasonique est fourni.
Introduction
Les fibroblastes sont des cellules plates en forme de fuseau avec de multiples processus stellate et un vaste réticulum approximatif brut1,2. Un fibroblaste moyen mesure 30 à 100 m et a une durée de vie de 57 à 3 jours1,3. La durée moyenne du cycle cellulaire des fibroblastes humains varie de 16 à 48 h selon les conditions de culture4. Il est prouvé que la capacité réplicative et la qualité fonctionnelle des fibroblastes primaires cultivés sont en corrélation négative avec l’âge du donneur, ce qui suggère que les donneurs plus jeunes (animaux ou patients) devraient être préférés si possible5,6 .
Les fibroblastes constituent un type cellulaire prédominant de la plupart des tissus du corps des mammifères. Malgré leur présence omniprésente, l’identification moléculaire des fibroblastes reste un défi7. Les fibroblastes migrent vers des tissus et des organes en développement provenant de différentes sources au cours du développement embryonnaire8. Pour cette raison, il existe une pléthore de protéines marqueurs que l’on peut trouver dans les fibroblastes alors que les protéines marqueurs uniques, qui sont présentes dans toutes les populations de fibroblastes et exclusives pour les fibroblastes, sont toujours manquantes. Ainsi, les modèles d’expression de plusieurs marqueurs reconnus sont habituellement utilisés pour identifier les fibroblastes. Parmi les marqueurs les plus reconnus sont la vimentine, la protéine de surface du fibroblaste humain (hFSP), le récepteur du domaine discoidin 2 (DDR2) et l’actine musculaire alpha lisse (SMA).
Les fibroblastes sont le type de cellule productrice de cellules productrices de matrice extracellulaire (ECM). Par conséquent, les fibroblastes maintiennent une architecture detissu ordonnée et fournissent le soutien mécanique pour les cellules voisines 1. L’équilibre entre la synthèse et la dégradation de l’ECM est un processus bien réglementé. Les changements vers la synthèse marquent le début d’un dépôt excessif d’ECM qui, s’il n’est pas terminé, conduit à la fibrose. La fibrose est médiée par les myofibroblastes, qui proviennent de fibroblastes activés subissant des changements moléculaires et phénotypiques. Une caractéristique des myofibroblastes est la sécrétion améliorée de l’ECM et des cytokines et l’expression de microfilaments arrangés par ordre9.
Les fibroblastes primaires ont été à l’honneur lors de recherches récentes portant sur la fibrose, l’inflammation des tissus et les interactions fibroblaste-cancer-cellule10,11. Cependant, pour étudier efficacement les propriétés du fibroblaste dans la santé et la maladie, il est nécessaire d’isoler les fibroblastes adultes primaires viables sur une base régulière. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour isoler les fibroblastes12,13,14. Les trois principales méthodes d’isolement de fibroblaste sont la croissance des morceaux de tissu12,digestion de tissu enzymatique15,et perfusion enzymatique des organes creux9,13,16. L’avantage de la croissance est un processus d’isolement doux sans dégradation cellulaire enzymatique. D’autre part, les cultures de croissance exigent habituellement des périodes de culture prolongées jusqu’à ce que les cellules puissent être employées pour des expériences. La digestion enzymatique commune est rapide mais comporte un risque de contamination avec d’autres types de cellules (par exemple, cellules endothéliales) ou des bactéries dans le processus d’agitation, qui est nécessaire pour dissoudre mécaniquement le tissu. En outre, ces méthodes sont souvent élaborées et nécessitent du temps et des compétences pour apprendre.
En ce qui concerne l’importance des fibroblastes primaires dans la recherche, il est encore nécessaire d’optimiser les approches existantes d’isolement cellulaire en termes de rapidité, de simplicité et de fiabilité. Ici, une nouvelle méthode d’isolement enzymatique enzymatique de fibroblaste à base d’ultrasons fournissant des cellules de haute qualité est fournie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par rapport aux lignées cellulaires de fibroblastes immortalisées, les fibroblastes primaires offrent plusieurs avantages. Ils peuvent être isolés de manière rentable en haute qualité et en quantité. En outre, les cultures primaires offrent la possibilité d’étudier des cellules de plusieurs individus, ce qui augmente la fiabilité des résultats obtenus et diminue la probabilité de simplement étudier les artefacts de culture cellulaire. La génération continue de nouvelles cultures primaires empêche les alt?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme Romy Kempe et Mme Annett Opitz pour leur soutien technique expert. Nous remercions également M. Bjoern Binnewerg pour son soutien informatique. Ce travail a été soutenu par des subventions de a) la Faculté de médecine Carl Gustav Carus Dresden et c) Else Kr’ner-Forschungskolleg (EKFK) Faculté de médecine Carl Gustav Carus Dresde. Nous sommes reconnaissants du financement et du soutien.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
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