초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리
Summary
우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.
Abstract
1 차적인 성인 섬유아세포는 모든 바디 조직에 있는 섬유증, 섬유아세포 상호 작용 및 염증을 공부하는 중요한 공구가 되었습니다. 1 차적인 섬유아세포는 myofibroblast 분화 또는 노화 유도 때문에 무기한 으로 분할할 수 없기 때문에, 새로운 문화는 정규로 설치되어야 합니다. 그러나 신뢰할 수있는 절연 프로토콜 및 1 차 섬유 아세포 격리 자체를 개발하는 과정에서 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다 : 방법의 난이도 (특히 초보자) 및 박테리아 오염의 위험, 1 차적인 섬유아세포가 실험, 및 후속 세포 질 및 생존을 위해 사용될 수 있을 때까지 필요한 시간. 본 연구에서는, 효소 소화 및 초음파 동요를 결합하는 마우스 심장, 폐, 간 및 신장으로부터 원발성 성인 섬유아세포를 분리하고 배양하는 빠르고 안정적이며 배우기 쉬운 프로토콜이 제공된다.
Introduction
섬유아세포는 여러 개의 성화 과정과 광범위한 거친 파구체 망상1,2를가진 평평한 스핀들 모양의 세포이다. 평균 섬유아세포는 30-100 μm을 측정하고 수명은57±3일 1,3. 인간 섬유아세포의 평균 세포 주기 지속 기간은 배양 조건에 따라 16-48h범위이다 4. 배양된 1차 섬유아세포의 복제 능력과 기능적 질이 기증자 연령과 부정적으로 상관된다는 증거가 있으며, 가능한 경우5,6을 통해 젊은 기증자(동물 또는 환자)를 선호해야 한다는 것을 시사합니다. .
섬유아세포는 대부분의 포유류 신체 조직의 우세한 세포 유형을 구성합니다. 그들의 유비쿼터스 존재에도 불구하고, 섬유아세포의 분자식별은 여전히 도전 7입니다. 섬유아세포는 배아 발달 동안 다른 근원에서 조직및 기관 개발로 이동8 . 이러한 이유로, 섬유아세포에서 찾아질 수 있는 마커 단백질의 과다가 있는 반면, 모든 섬유아세포 집단에서 존재하고 섬유아세포에 대한 독점적인 유일한 마커 단백질은 아직도 누락됩니다. 따라서, 몇몇 인식된 마커의 발현 패턴은 일반적으로 섬유아세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 가장 인식되는 마커 중에는 비멘틴, 인간 섬유아세포 표면 단백질(hFSP), 디스코이딘 도메인 수용체 2(DDR2) 및 알파 평활근 액틴(αSMA)이 있다.
섬유아세포는 주요 세포외 기질(ECM) 생산 세포 유형입니다. 이에 따라 섬유아세포는 질서 정연한 조직 구조를유지하고 인접한 세포에 대한 기계적 지지를 제공한다 1. ECM 합성과 분해 사이의 균형은 잘 조절 된 과정입니다. 합성으로 이동 하는 과도 한 ECM 증착의 시작을 표시 하는, 종료 하지 않을 경우, 섬유증에 이르게. 섬유증은 분자 및 현상형 변경을 겪고 있는 활성화된 섬유아세포에서 유래한 근섬유아세포에 의해 중재됩니다. 근섬유아세포의 한 가지 특징은 ECM 및 사이토카인의 분비 및 질서 정연하게 배열된αSMA 마이크로필라멘트의 발현이다 9.
1차 섬유아세포는 섬유증, 조직염증 및 섬유아세포-암-세포 상호작용10,11에초점을 맞춘 최근 연구의 각광을 받고 있다. 그러나, 건강과 질병에 있는 섬유아세포 특성을 효과적으로 연구하기 위하여는, 실행 가능한 일차 성인 섬유아세포를 정기적으로 격리할 필요가 있습니다. 섬유아세포12,13,14를분리하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 섬유아세포 분리의 세 가지 주요 방법은 조직 덩어리12,효소 조직 소화15,중공 장기9,13,16의효소 관류에서 자라낸다. 자성장의 장점은 효소 세포 분해없이 부드러운 절연 공정이다. 다른 한편으로는, 파생 배양은 일반적으로 세포가 실험을 위해 이용될 수 있을 때까지 연장된 배양 기간을 요구합니다. 일반적인 효소 소화는 빠르지만 조직을 기계적으로 용해시키는 데 필요한 교반 과정에서 다른 세포 유형 (예 : 내피 세포) 또는 박테리아와 오염 될 위험이 있습니다. 또한, 이러한 방법은 종종 정교하고 배울 시간과 기술이 필요합니다.
연구에서 1 차적인 섬유아세포의 중요성에 관하여, 민첩성, 단순성 및 신뢰성의 관점에서 기존 세포 격리 접근을 낙관할 필요가 아직도 있습니다. 여기서, 고품질 세포를 제공하는 새로운 초음파 기반 효소 섬유아세포 분리 방법이 제공된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
불멸의 섬유아세포주와 비교하여, 1차 섬유아세포는 몇 가지 장점을 제공한다. 그들은 높은 품질과 수량에서 비용 효율적으로 격리 될 수있다. 게다가, 1 차적인 배양은 다중 개별에게서 세포를 공부하는 가능성을 제안합니다, 얻어진 결과의 신뢰성을 증가시키고 단지 세포 배양 유물을 공부의 가능성을 감소시킵니다. 새로운 1 차 적인 배양물의 연속적인 생성은 일반적으로 통과하는 반복한 후에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
로미 켐프 부부와 아넷 오피츠 부인에게 전문적인 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 IT 지원에 대한 씨 Bjoern Binnewerg 감사합니다. 이 작품은 a) Förderkreis 드레스드너 헤르츠 – Treislauf-Tage e.V., b) “Habilitationsförderprogramm für 프라우엔”, 의학 학부 칼 구스타프 카루스 드레스덴과 c) 엘스 크뢰너 – 포르스충스콜레그 (EKFK) 칼 의학부에서 보조금에 의해 지원되었다 카루스 드레스덴. 우리는 자금과 지원에 감사드립니다.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
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