Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso
Summary
Il metodo presentato combina l’analisi quantitativa delle interruzioni del DNA a doppio filamento (DSB), la distribuzione del ciclo cellulare e l’apoptosi per consentire la valutazione specifica del ciclo cellulare dell’induzione e della riparazione di DSB, nonché le conseguenze del fallimento della riparazione.
Abstract
Il metodo presentato o versioni leggermente modificate sono state ideate per studiare risposte specifiche al trattamento e gli effetti collaterali di vari trattamenti anti-cancro utilizzati nell’oncologia clinica. Consente un’analisi quantitativa e longitudinale della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico, come indotto dalla radioterapia e da una moltitudine di farmaci anti-cancro. Il metodo copre tutte le fasi della risposta al danno del DNA, fornendo endpoint per l’induzione e la riparazione di rotture a doppio filamento del DNA (DSB), l’arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare per apoptosi in caso di guasto di riparazione. La combinazione di queste misurazioni fornisce informazioni sugli effetti di trattamento dipendenti dal ciclo cellulare e consente quindi uno studio approfondito dell’interazione tra la proliferazione cellulare e i meccanismi di coping contro il danno al DNA. Poiché l’effetto di molte terapie contro il cancro, tra cui agenti chemioterapici e radiazioni ionizzanti, è limitato o varia fortemente in base a specifiche fasi del ciclo cellulare, le analisi correlate si basano su un metodo robusto e fattibile per valutare gli effetti del trattamento sul DNA in modo specifico per il ciclo cellulare. Questo non è possibile con i saggi a endpoint singolo e un importante vantaggio del metodo presentato. Il metodo non è limitato a nessuna linea cellulare particolare ed è stato accuratamente testato in una moltitudine di linee tumorali e normali delle cellule tissutali. Può essere ampiamente applicato come un test completo di genotossicità in molti campi dell’oncologia oltre alla radio-oncologia, tra cui la valutazione del fattore di rischio ambientale, lo screening farmacologico e la valutazione dell’instabilità genetica nelle cellule tumorali.
Introduction
L’obiettivo dell’oncologia è quello di uccidere o inattivare le cellule tumorali senza danneggiare le cellule normali. Molte terapie o direttamente o indirettamente inducono stress genotossico nelle cellule tumorali, ma anche ad alcuni si estendono nelle cellule normali. La chemioterapia o i farmaci mirati sono spesso combinati con la radioterapia per migliorare la radiosensibilità del tumore irradiato1,2,3,4, 5, che consente una riduzione di la dose di radiazioni per ridurre al minimo i normali danni ai tessuti.
Le radiazioni ionizzanti e altri agenti genotossici inducono diversi tipi di danni al DNA, tra cui modifiche alla base, collegamenti di filamento e rotture a singolo o doppio filamento. Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) sono le lesioni più gravi del DNA e la loro induzione è fondamentale per l’effetto di uccisione delle cellule delle radiazioni ionizzanti e di vari farmaci citostatici nella radiochemioterapia. I DSB non solo danneggiano l’integrità del genoma, ma promuovono anche la formazione di mutazioni6,7. Pertanto, diversi percorsi di riparazione DSB, e meccanismi per eliminare le cellule irreparabilmente danneggiate come l’apoptosi si sono sviluppati durante l’evoluzione. L’intera risposta al danno del DNA (DDR) è regolata da una complessa rete di percorsi di segnalazione che raggiungono il riconoscimento dei danni del DNA e l’arresto del ciclo cellulare per consentire la riparazione del DNA, la morte cellulare programmata o l’inattivazione in caso di guasto di riparazione8.
Il metodo citometrico del flusso presentato è stato sviluppato per studiare la DDR dopo lo stress genotossico in un test completo che copre l’induzione e la riparazione di DSB, nonché le conseguenze del guasto alla riparazione. Combina la misurazione del marcatore DSB ampiamente applicato: HH2AX con l’analisi del ciclo cellulare e l’induzione dell’apoptosi, utilizzando l’analisi classica subG1 e una valutazione più specifica dell’attivazione della caspase-3.
La combinazione di questi endpoint in un’unica analisi non solo riduce le spese di tempo, manodopera e costi, ma consente anche la misurazione specifica del ciclo cellulare dell’induzione e della riparazione di DSB, nonché l’attivazione della caspase-3. Tali analisi non sarebbero possibili con i saggi condotti in modo indipendente, ma sono molto rilevanti per una comprensione completa della risposta al danno del DNA dopo lo stress genotossico. Molti farmaci anticancro, come i composti citostatici, sono diretti contro la divisione delle cellule e la loro efficienza è fortemente dipendente dallo stadio del ciclo cellulare. La disponibilità di diversi processi di riparazione DSB dipende anche dalla fase del ciclo cellulare e dalla scelta del percorso che è fondamentale per la precisione di riparazione, e a sua volta determina il destino della cella9,10,11, 12. Inoltre, la misurazione specifica del ciclo cellulare dei livelli di DSB è più accurata dell’analisi in pool, perché i livelli di DSB non dipendono solo dalla dose di un composto o radiazione genotosi, ma anche dal contenuto di DNA della cellula.
Il metodo è stato utilizzato per confrontare l’efficacia di diverse radioterapie per superare i meccanismi di resistenza nel glioblastoma13 e per analizzare l’interazione tra radiazioni ionizzanti e farmaci mirati nell’osteosarcoma14,15 e tumori teratoidi atipici16. Inoltre, il metodo descritto è stato ampiamente utilizzato per analizzare gli effetti collaterali della radio e della chemioterapia sulle cellule staminali mesenchymale17,18,19,20,21, 22,23,24, che sono essenziali per la riparazione del danno tissutale normale indotto dal trattamento e hanno una potenziale applicazione nella medicina rigenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo in primo piano è facile da usare e offre una misurazione veloce, accurata e riproducibile della risposta al danno del DNA, tra cui l’induzione e la riparazione a doppio filamento (DSB), effetti del ciclo cellulare e morte delle cellule apoptotiche. La combinazione di questi endpoint fornisce un quadro più completo delle loro interrelazioni rispetto ai singoli saggi. Il metodo può essere ampiamente applicato come un test completo sulla genotossicità nei campi della biologia delle radiazioni, della terapia e …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il team di Flow Cytometry Facility presso il German Cancer Research Center (DKF) per il loro supporto.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
Riferimenti
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