유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정
Summary
제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.
Abstract
제시된 방법 또는 약간 변형된 버전은 임상 종양학에서 사용된 것과 같이 각종 항암 처리의 특정 처리 반응 그리고 부작용을 공부하기 위하여 고안되었습니다. 방사선 요법과 다수의 항암 제에 의해 유도된 바와 같이, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응의 정량적 및 세로 분석을 가능하게 한다. 이 방법은 DNA 손상 반응의 모든 단계를 커버, DNA 이중 가닥 휴식의 유도 및 수리를위한 엔드 포인트를 제공 (DSBs), 세포 주기 체포 및 수리 실패의 경우 세포 사멸에 의한 세포 사망. 이 측정을 결합하는 것은 세포 주기 의존적인 처리 효력에 관하여 정보를 제공하고, 이렇게 DNA 손상에 대하여 세포 증식과 대처 기계장치 사이 상호 작용의 심층적인 연구를 허용합니다. 화학요법제 및 이온화 방사선을 포함한 많은 암 치료제의 효과는 특정 세포 주기 단계에 따라 제한되거나 강하게 변화하기 때문에, 상관분석은 치료 효과를 평가하기 위한 강력하고 실행 가능한 방법에 의존합니다. 세포 주기 특정 방식으로 DNA에. 이것은 단일 엔드포인트 어세이와 제시된 방법의 중요한 이점으로는 불가능합니다. 이 방법은 임의의 특정 세포주에 제한되지 않으며 다수의 종양 및 정상 조직 세포주에서 철저히 시험되었다. 종양 세포의 유전적 불안정성 평가, 약물 스크리닝 및 평가를 포함하여 방사선 종양학 외에 종양학의 많은 분야에서 포괄적인 유전독성 분석술로 널리 적용될 수 있다.
Introduction
종양학의 목표는 정상적인 세포를 손상시키지 않고 암세포를 죽이거나 비활성화하는 것입니다. 많은 치료는 직접 또는 간접적으로 암세포에서 유전자 독성 스트레스를 유도하지만, 일부는 정상 세포에서 확장됩니다. 화학요법 또는 표적 약물은 종종 방사선 요법과 결합되어 조사된종양 1, 2,3,4,5의방과민성을 향상시킵니다. 방사선 선량은 정상적인 조직 손상을 최소화합니다.
이온화 방사선 및 기타 유독성 제제는 염기 수정, 가닥 가교 및 단일 또는 이중 가닥 파손을 포함한 다양한 종류의 DNA 손상을 유발합니다. DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는 가장 심각한 DNA 병변이고 그들의 유도는 방사선과 방사선 화학요법에 있는 각종 세포 성 약의 세포 살해 효력의 열쇠입니다. DSB는 게놈의 무결성을 해칠뿐만 아니라 돌연변이 6,7의형성을촉진합니다. 따라서, 다른 DSB 수리 경로, 및 세포 사멸 과 같은 돌이킬 수없는 손상된 세포를 제거하는 메커니즘은 진화 중에 개발되었다. 전체 DNA 손상 반응(DDR)은 DNA 손상 인식 및 세포 주기 검거로부터 DNA 복구, 프로그램된 세포 사멸 또는 수리 실패시불활성화에 이르는 신호 경로의 복잡한 네트워크에 의해 조절된다 8.
제시된 유동 세포 측정 방법은 DSB 유도 및 수리뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 포함하는 하나의 포괄적 인 분석에서 유독성 스트레스 후 DDR을 조사하기 위해 개발되었습니다. 그것은 고전적인 subG1 분석 및 caspase-3 활성화의 더 구체적인 평가를 사용하여 세포 주기 및 세포 사멸의 유도의 분석과 널리 적용되는 DSB 마커 γH2AX의 측정을 결합합니다.
하나의 분석에서 이러한 엔드포인트의 조합은 시간, 인건비 및 비용 비용을 감소시킬 뿐만 아니라 Caspase-3 활성화뿐만 아니라 DSB 유도 및 수리의 세포 주기별 측정을 가능하게 합니다. 이러한 분석은 독립적으로 수행 된 분석으로는 불가능하지만, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응에 대한 포괄적 인 이해를 위해 매우 관련이 있습니다. 세포성 화합물과 같은 많은 항암제는 세포 분열에 대해 지시되며 그 효율은 세포 주기 단계에 크게 의존합니다. 상이한 DSB 수리 공정의 가용성은 또한 수리 정확도에 중요한 세포 주기 단계 및 경로 선택에 따라 달라지며, 차례로셀9,10,11의운명을 결정합니다. 12. 또한, DSB 수준은 유독성 화합물 또는 방사선의 투여량뿐만 아니라 세포의 DNA 함량에 의존하기 때문에 DSB 수준의 세포 주기별 측정은 풀화 분석보다 더 정확하다.
이 방법은 교모세포종13에서 내성 메커니즘을 극복하고 골육종14,15에서 이온화 방사선과 표적 약물 간의 상호 작용을 해부하기 위해 다른 방사선 요법의 효능을 비교하는 데 사용되었습니다. 및 비정형 테라로이드 라브도이드 암16. 또한, 기재된 방법은 중간엽 줄기세포17,18,19,20,21, 22,23,24,이는 치료 유도 정상 조직 손상의 수리에 필수적이며 재생 의학에서 잠재적 인 응용 프로그램을 갖는다.
Protocol
Representative Results
Discussion
추천된 방법은 사용하기 쉽고 이중 가닥 브레이크(DSB) 유도 및 수리, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 포함한 DNA 손상 반응의 빠르고 정확하며 재현 가능한 측정을 제공합니다. 이러한 끝점의 조합은 개별 적인 비약적인 비고지 보다는 그들의 상호 관계의 더 완전한 그림을 제공합니다. 이 방법은 방사선 생물학, 치료 및 보호, 그리고 종양학 (예를 들어, 환경 위험 요소 평가, 약물 스크리닝 및 유전 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 독일 암 연구 센터 (DKFZ)의 흐름 세포 측정 시설 팀에게 그들의 지원에 감사드립니다.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
Riferimenti
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