Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo
Summary
O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.
Abstract
O método apresentado ou versões ligeiramente modificadas foram concebidas para estudar respostas específicas de tratamento e efeitos colaterais de vários tratamentos anticancerígenos utilizados na oncologia clínica. Permite uma análise quantitativa e longitudinal da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico, como induzido pela radioterapia e por uma multidão de drogas anticancerígenas. O método abrange todas as fases da resposta ao dano do DNA, proporcionando desfechos para indução e reparo de quebras de dupla vertente de DNA (DSBs), prisão por ciclo celular e morte celular por apoptose em caso de falha no reparo. Combinar estas medidas fornece a informação sobre efeitos ciclo-dependentes do tratamento da pilha e permite assim um estudo detalhado do interação entre a proliferação celular e os mecanismos de enfrentamento de encontro aos danos do ADN. Como o efeito de muitos terapêutica oncológica, incluindo agentes quimioterápicos e radiação ionizante é limitado ou fortemente varia de acordo com as fases específicas do ciclo celular, análises correlativas dependem de um método robusto e viável para avaliar os efeitos do tratamento no DNA de uma forma específica do ciclo celular. Isso não é possível com ensaios de ponto de extremidade único e uma vantagem importante do método apresentado. O método não é restrito a qualquer linha celular em particular e foi exaustivamente testado em uma infinidade de tumores e linhas celulares normais do tecido. Pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente em muitos campos de Oncologia, além de rádio-oncologia, incluindo avaliação de fatores de risco ambiental, triagem de drogas e avaliação da instabilidade genética em células tumorais.
Introduction
O objetivo da Oncologia é matar ou inativar as células cancerosas sem prejudicar as células normais. Muitas terapias, direta ou indiretamente, induzem o estresse genotóxico em células cancerosas, mas também para alguns se estendem em células normais. A quimioterapia ou as drogas alvejadas são combinadas frequentemente com a radioterapia para realçar a radiosensibilidade do tumor irradiado1,2,3,4,5, que permite uma redução de a dose de radiação para minimizar os danos teciduais normais.
A radiação ionizante e outros agentes genotóxicos induzem diferentes tipos de danos ao DNA, incluindo modificações de base, ligações cruzadas e quebras de fio simples ou duplo. As rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs) são as lesões as mais sérias do ADN e sua indução é chave ao efeito da matança da pilha da radiação ionizante e das várias drogas cytostatic na radioquimioterapia. Os DSBs não só prejudicam a integridade do genoma, mas também promovem a formação de mutações6,7. Conseqüentemente, as rotas diferentes do reparo de DSB, e os mecanismos para eliminar pilhas irreparàvel danificadas como o apoptose desenvolveram durante a evolução. A resposta inteira do dano do ADN (DDR) é regulada por uma rede complexa de vias de sinalização que alcangam do reconhecimento de dano do ADN e da apreensão do ciclo de pilha para permitir o reparo do ADN, à morte de pilha programada ou à inactivação em caso da falha do reparo8.
O método cytometric do do fluxo apresentado foi desenvolvido para investigar o DDR após o esforço genotóxico em um ensaio detalhado que cubra a indução e o reparo de DSB, assim como conseqüências da falha do reparo. Combina a medida do marcador amplamente aplicado γH2AX do DSB com análise do ciclo da pilha e da indução do apoptosis, usando a análise subG1 clássica e uma avaliação mais específica da ativação do caspase-3.
A combinação destes valores-limite em um ensaio reduz não somente o tempo, o trabalho e as despesas de custo, mas igualmente permite a medida ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB, assim como a ativação de caspase-3. Tais análises não seriam possíveis com ensaios conduzidos independentemente, mas são altamente relevantes para uma compreensão detalhada da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico. Muitas drogas anti-câncer, tais como compostos citostáticos, são dirigidas contra a divisão de células e sua eficiência é fortemente dependente da fase de ciclo celular. A disponibilidade de diferentes processos de reparo do DSB também depende do estágio do ciclo celular e da escolha do caminho que é crítico para a precisão do reparo, e por sua vez determina o destino da célula9,10,11, doze anos. Além, a medida ciclo-específica da pilha de níveis de DSB é mais exata do que a análise agrupada, porque os níveis de DSB são não somente dependentes da dose de um composto ou de uma radiação genotóxico, mas igualmente no índice do ADN da pilha.
O método tem sido utilizado para comparar a eficácia de diferentes radioterapias para superar os mecanismos de resistência no glioblastoma13 e dissecar a interação entre radiação ionizante e drogas direcionadas em osteossarcoma14,15 e cancros rhabdoid teratoides atípicos16. Adicionalmente, o método descrito tem sido amplamente utilizado para analisar os efeitos colaterais da rádio e da quimioterapia nas células-tronco mesenquimais17,18,19,20,21, 22,23,24, que são essenciais para o reparo de dano de tecido normal induzido pelo tratamento e têm uma aplicação potencial na medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método caracterizado é fácil de usar e oferece uma medida rápida, exata e reprodutível da resposta de dano do ADN que inclui a indução e o reparo da ruptura da dobro-Costa (DSB), os efeitos do ciclo de pilha e a morte da pilha apoptóticas. A combinação desses Endpoints fornece um quadro mais completo de suas inter-relações do que os ensaios individuais. O método pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente nos campos de biologia de radiação, terapia e proteção, e mais geralm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a equipe de facilidade de citometria de fluxo no centro de pesquisa de câncer da Alemanha (DKFZ) por seu apoio.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
Riferimenti
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