在这里,我们提出了一种可靠、微创且经济高效的方法来记录和解释活麻醉成年斑马鱼的心电图。
成年斑马鱼的心电图波形与人类的电心图波形非常相似。这些心电图相似性不仅提高了斑马鱼作为人类心脏电生理学和肌病研究模型的价值,而且作为高通量药物筛查中的潜在心肌毒性的代理模型。人,如QT延长。因此,成年斑马鱼体内心电图是一种电表型工具,对于横截面或纵向的体内电生理表征是必要的,如果不是不可或缺的的话。然而,由于缺乏可靠、实用和具有成本效益的记录方法,往往仍然是防止这种体内诊断工具更容易获得的主要挑战。在这里,我们描述了一种实用、直接的成人斑马鱼体内心电图方法,使用低维护、经济高效和全面的系统,可生成一致、可靠的记录。我们用12-18个月大的健康成年雄性斑马鱼来说明我们的方案。我们还引入了快速的实时解释策略,用于质量验证,以确保数据的准确性和鲁棒性,在心电图记录过程的早期。
斑马鱼 (达尼奥雷里奥) 心脏位于胸腔和胸围腰围之间的胸腔。心脏被封闭得相当松散,在一个银色的心包囊。从解剖学上讲,斑马鱼的心脏不同于四室的人类和其他哺乳动物的心脏,因为它的体积很小(比人类心脏小100倍),并且其双室结构仅由一个中庭和一个心室组成。尽管如此,心电图(ECG)波形和两个物种的QT间隔持续时间非常相似(图1)。因此,斑马鱼已成为研究人类遗传性心律失常1、2、3和高通量药物筛选潜在人类心毒性的常用模型4,5,如 QT 延长。
在人类心脏疾病的常规评估中,人体表面心电图自1903年埃因霍温发明以来,已成为使用最广泛的一线非侵入性诊断工具。相比之下,自2006年首次对成年斑马鱼进行体面心电图记录方法的改造,以及此后的7次修改以来,尽管该领域的许多研究人员基本上无法进入这项技术。这种动物模型的流行。对于对成年斑马鱼进行体内心电图询问的其他研究人员,操作者之间的巨大差异导致不同研究的ECG结果不一致。常见的原因包括繁琐和昂贵的专用设备和软件、低信噪比以及电极放置方面的混淆,所有这些都因对成年斑马鱼心电图功能的不完全了解而进一步恶化。基础组织机制。鉴于体内心电图是电表型活斑马鱼的唯一诊断工具,显然需要一种标准化方法,以提高灵敏度和特异性、可重复性和可访问性。
在这里,我们提出了一个实用,可靠和验证的方法,记录和解释斑马鱼在体内心电图(图2)。利用前平面的单双极铅,我们研究了活体麻醉健康野生型AB成年斑马鱼的ECG波形和间隔持续时间的变化。
如本研究所示,当通过单一铅记录成年斑马鱼体内心电图时,对ECG记录结果的质量和有效性有许多警告。首先,在选择适当的麻醉剂和确定所需的最小麻醉浓度、深度和持续时间时,平衡麻醉心毒性与抑制运动伪影的迫切需要和先前确定的麻醉量。生存与终端实验设计。利用不同药物类别5、14和麻痹剂1、6的多种麻醉剂组合的协同增效作用,降低单个制剂5的剂量或施用高诱导剂量后维持剂量低是典型的策略。然而,尽管它是众所周知的潜在的心肺毒性,包括死亡8,三联苯仍然是使用最广泛,最好的可用,和唯一的麻醉剂批准美国食品和药物管理局(FDA)为斑马鱼麻醉。三氯苯甲酸已普遍用于成人斑马鱼的ECG记录,无论是作为单一剂,还是与其他麻醉剂或麻痹剂结合使用。
其次,使用我们对于正常成年斑马鱼心电图的四个验证标准,至少可以确保正常斑马鱼的铅放置精度。在我们在这里提出的四个验证标准中,最后两个标准共同证实了R波的极性与正常心电图5、7、15中T波的极性之间的基本一致性。这种R和T波协调是斑马鱼和人类16、17正常心电图之间的偶然但关键的相似性,有助于斑马鱼心脏模型作为人类心脏的代用品的临床相关性电 生理。但是,几种良性或恶性条件可能使四个验证标准中的任何一个失效。例如,R和T波协调在心肌缺血7,15中丢失。心肌缺血中R波和T波协调的丧失是斑马鱼与人类心电图之间的又一显著相似性,有助于斑马鱼心肌梗死模型的临床相关性。
最后,我们推荐了心电图分析的标准实践。随着技术的出现,心电图分析软件可以生成自动心电图解算。然而,我们强烈建议,受过训练的人应始终重新解释和验证所有心电图基于相应的临床场景导致心电图记录。通常完全依赖ECG分析软件的自动解释是不可取的,特别是在存在常见的正常心电图变异、心脏病变或铅位次优的情况下。
本研究侧重于用于短暂心电图记录会话的微创方法。然而,如果需要终端长时间的心电图记录会话持续几个小时,修改是必要的,以提供足够的氧合,水化和麻醉通过连续灌注6。
此外,至少通过三种方式之一来提高信噪比。选择更强大的放大器通常是一个昂贵的,如果不是不切实际的选择。打开心包囊以减少体积导体是一种合理的,虽然具有侵入性,方法已被采用7。战略性引线放置以与主心轴平行的方向对齐引线轴(图 4B)将最大化心电图电压信号,但可能需要反复试验,尤其是在无心度切除术的情况下。
我们在这里介绍的成年斑马鱼体内心电图查询方法具有四个主要优点。首先,我们的微创方法只需要电极插入,但没有鱼鳞切除或胸腔外胸切除术。因此,通过尽量减少鱼的痛苦,我们的方法允许在纵向生存研究中重复心电图询问。其次,当麻醉剂充分抑制鱼的运动时,我们研究中的体内心电图记录系统始终能产生令人满意的信噪比和无噪声原始信号。第三,我们在这里提出的四标准质量验证可确保在 ECG 数据采集的早期数据准确性和鲁棒性,并最大限度地减少与操作员相关的变化。最后,特别是,我们最后的验证标准(正常T波是直立的)封装了R波和T波的和谐,这是斑马鱼正常心电图的一个重要的人类特征(图1)。
然而,目前我们小组和其他人对成年斑马鱼体内心电图方法仍存在四个主要限制。
首先,缺乏受试者合作需要麻醉,其限制心肺毒性后果。对于体内心电图询问,而人类患者从来不需要镇颤,斑马鱼总是需要麻醉剂或麻痹,所有这些都会导致多变的心肺毒性。
其次,需要保护附加的心电图导致稍微提高其他非侵入性程序的侵入性。虽然人类在人体表面心电图记录中的铅放置是完全非侵入性的,因为电极粘附在人类表皮上,而斑马鱼体内心电图记录的铅放置更具侵入性,因为至少,钢电极必须穿刺鱼皮,以便安全地插入鱼肌肉。
最后两个限制源于斑马鱼胸部和心脏的解剖约束。第三,成年斑马鱼心脏的极小尺寸要求大幅度减少心电图引线的数量。虽然人类在标准心电图记录中很容易容纳12条引线,但成年斑马鱼通常只能容纳单极或双极引线。单个 ECG 引线的冲压是同时优化所有三个 P、R 和 T 波振幅的挑战。因此,斑马鱼心电图询问中最佳和准确铅放置的重要性怎么强调也不为过。在斑马鱼中,T波是一个独特的检测挑战,因为它通常是这三个波中最小的。因此,斑马鱼T波振幅应优先于通常较大的P波和R波。
第四,确定斑马鱼主心轴以最大化R波振幅可能具有挑战性。原因是斑马鱼心脏在其松散的心包内比人的心脏在其形式适合手套状的心形内有更多的运动自由。
总体而言,这些限制将刺激未来的方法创新。随着3D打印和可变形电子18的出现,有希望有一天,使用无线电极传感器的”心脏袜子”,在清醒、警觉、游泳的斑马鱼中直接植入铅。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究院R01 HL141452到TPN的支持。ADTiS提供慷慨的资金,以支付开放获取出版的费用,但在实验设计、数据采集、本研究数据分析或出版前对手稿的任何访问方面没有任何作用。
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |