Aquí, presentamos un método confiable, mínimamente invasivo y rentable para registrar e interpretar electrocardiogramas en peces de cebra adultos anestesiados vivos.
Las formas de onda del electrocardiograma del pez cebra adulto y las de los humanos son notablemente similares. Estas similitudes de electrocardiograma mejoran el valor del pez cebra no sólo como modelo de investigación para la electrofisiología cardíaca humana y miopatías, sino también como un modelo sustituto en la detección farmacéutica de alto rendimiento para posibles cardiotoxicidades humanos, como la prolongación del intervalo QT. Como tal, la electrocardiografía in vivo para peces cebra adultos es una herramienta de fenotipado eléctrico que es necesaria, si no indispensable, para caracterizaciones electrofisiológicas in vivo transversales o longitudinales. Sin embargo, con demasiada frecuencia, la falta de un método de grabación fiable, práctico y rentable sigue siendo un desafío importante que impide que esta herramienta de diagnóstico in vivo sea más accesible. Aquí, describimos un enfoque práctico y directo de la electrocardiografía in vivo para peces cebra adultos utilizando un sistema de bajo mantenimiento, rentable y completo que produce grabaciones consistentes y confiables. Ilustramos nuestro protocolo utilizando peces cebra macho adultos sanos de 12-18 meses de edad. También introducimos una rápida estrategia de interpretación en tiempo real para la validación de la calidad para garantizar la precisión de los datos y la robustez al principio del proceso de grabación del electrocardiograma.
El corazón del pez cebra (Danio rerio) se encuentra anteroventrally a la cavidad torácica entre el opérculo y las fajas pectorales. El corazón está encerrado bastante holgadamente dentro de un saco pericárdico de color plateado. Anatómicamente, el corazón del pez cebra es diferente de los corazones humanos de cuatro cámaras y otros mamíferos debido a su escala diminuta (100 veces más pequeña que el corazón humano) y su estructura de dos cámaras que consiste en sólo una aurícula y un ventrículo. No obstante, las formas de onda del electrocardiograma (ECG) y laduración del intervalo QT de ambas especies son notablemente similares (Figura 1). En consecuencia, el pez cebra ha surgido como un modelo popular para el estudio de las arritmias heredadas humanas1,2,3 y para la detección de drogas de alto rendimiento de posibles cardiotoxicidades humanas4,5 , como la prolongación del INTERVALO.
En la evaluación rutinaria de las enfermedades cardíacas humanas, el ECG de superficie corporal se ha convertido en la herramienta de diagnóstico no invasiva de primera línea más ampliamente utilizada desde su invención por Einthoven en 1903. En cambio, desde la primera adaptación del método de registro de ECG de superficie corporal para peces cebra adultos en 20066 y varias modificaciones a partir de entonces7, esta técnica ha permanecido en gran medida inaccesible para muchos investigadores en el campo a pesar de la popularidad de este modelo animal. Para otros investigadores que realizaron interrogaciones in vivo de ECG para peces cebra adultos, amplias variaciones entre los operadores llevaron a la incoherencia en los hallazgos de ECG de diferentes estudios. Las razones comunes incluyen dispositivos y software especializados engorrosos y costosos, baja relación señal-ruido y confusión con respecto a la colocación del electrodo, todo agravado por una comprensión incompleta de las características de ECG de pez cebra para adultos y mecanismos tisulares subyacentes. Dado que el ECG in vivo es la única herramienta de diagnóstico para el fenotipo eléctrico de pez cebra vivo, existe una clara necesidad de un método estandarizado para mejorar la sensibilidad y especificidad, reproducibilidad y accesibilidad.
Aquí, presentamos un enfoque práctico, confiable y validado para registrar e interpretar los electrocardiogramas in vivo del pez cebra (Figura2). Usando un solo cable bipolar en el plano frontal, investigamos los cambios en las formas de onda de ECG y las duraciones de intervalos del pez cebra adulto aB saludable anestetizado vivo.
Al registrar in vivo ECG para peces cebra adultos por medio de una sola ventaja como hemos demostrado en este estudio, hay una serie de advertencias relativas a la calidad y validez de los resultados del registro del ECG. En primer lugar, al elegir los anestésicos apropiados y determinar la concentración mínima necesaria de anestesia, profundidad y duración, equilibrar las cardiotoxicidades anestésicas contra la necesidad crítica de suprimir los artefactos de movimiento y la determinación a priori para un diseño experimental de supervivencia frente a terminal. Aprovechar la potencia sinérgica de una combinación de anestésicos múltiples de diferentes clases de fármacos5,14 y paralíticos1,6 para reducir la dosis de agentes individuales5 o administrar una dosis de bajo mantenimiento después de una dosis de inducción más alta son estrategias típicas. Sin embargo, a pesar de sus conocidas toxicidades cardiorrespiratorias potenciales, incluyendo la muerte8, la tricaína sigue siendo la más utilizada, la mejor disponible, y el único anestésico aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el pez cebra Anestesia. La tricaína se ha utilizado popularmente en la grabación de ECG de pez cebra adulto ya sea como un solo agente o en combinación con otros anestésicos o paralíticos.
En segundo lugar, se puede garantizar la precisión de la colocación del plomo al menos para el pez cebra normal y saludable utilizando nuestros cuatro criterios de validación para un ECG de pez cebra adulto normal. De los cuatro criterios de validación que proponemos aquí, los dos últimos criterios juntos confirman la concordancia fundamental entre la polaridad de la onda R y la de la onda T en un ECG5normal,7,15. Esta concordancia de ondas R y T es una similitud fortuita, pero crítica, entre el pez cebra y el ECG humano16,17 ECG normal que contribuye a la relevancia clínica del modelo del corazón del pez cebra como sustituto del Electrofisiología. Sin embargo, varias afecciones benignas o malignas pueden invalidar cualquiera de los cuatro criterios de validación. Por ejemplo, la concordancia de onda R y T se pierde en la isquemia miocárdica7,15. Esta pérdida de concordancia de ondas R y T en la isquemia miocárdica es otra semejanza llamativa entre el pez cebra y el ECG humano que contribuye a la relevancia clínica del modelo de infarto de miocardio del pez cebra.
Por último, recomendamos una práctica estándar en el análisis de ECG. Con la llegada de la tecnología, el software de análisis eclovenpuede generar interpretación automática de ECG. Sin embargo, recomendamos encarecidamente que los seres humanos entrenados siempre reinterpreten y verifiquen todos los ECG en función del escenario clínico respectivo que conduce a la grabación de ECG. La excesiva dependencia rutinaria únicamente de la interpretación automática por parte de un software de análisis de ECG es desaconsejable, particularmente en presencia de variantes comunes normales de ECG, patologías cardíacas o colocación de plomo subóptima.
Este estudio se centra en el método mínimamente invasivo para breves sesiones de grabación de ECG. Sin embargo, en caso de que surja la necesidad de sesiones de registro de ECG prolongadas terminales que duran horas, las modificaciones son necesarias para proporcionar la oxigenación adecuada, hidratación y anestesia por perfusión continua6.
Además, mejore la relación señal-ruido de al menos tres maneras. Elegir un amplificador más potente es a menudo una opción costosa, si no poco práctica. Abrir el saco pericárdico para reducir el conductor de volumen es un enfoque razonable, aunque invasivo, que se ha adoptado7. La colocación estratégica del cable para alinear el eje de plomo en una dirección paralela al eje cardíaco principal (Figura4B)maximizará las señales de voltaje del ECG, pero puede requerir ensayo y error, especialmente en ausencia de pericardiotomía.
El método de interrogación in vivo de ECG para el pez cebra adulto que presentamos aquí ofrece cuatro ventajas principales. En primer lugar, nuestro enfoque mínimamente invasivo solo requiere la inserción de electrodos, pero no la eliminación de la escala de pescado ni la toracotomía-pericardiotomía. Por lo tanto, al minimizar el dolor para los peces, nuestro enfoque permite interrogaciones repetidas de ECG en estudios de supervivencia longitudinal. En segundo lugar, cuando los anestésicos suprimen adecuadamente el movimiento de los peces, el sistema de grabación ecg in vivo de nuestro estudio produce constantemente una relación señal-ruido satisfactoria con señales brutas libres de ruido. En tercer lugar, la validación de calidad de cuatro criterios que proponemos aquí garantiza la precisión y robustez de los datos al principio de la adquisición de datos del ECG y minimiza las variaciones dependientes del operador. Por último, en particular, nuestro último criterio de validación (la onda T normal es vertical) encapsula la concordancia de la onda R y la onda T, una característica importante similar al humano del ECG normal del pez cebra (Figura1).
Sin embargo, todavía existen cuatro limitaciones principales a la metodología actual de ECG in vivo para el pez cebra adulto por nuestro grupo y otros.
En primer lugar, la falta de cooperación en el tema requiere la necesidad de anestesia con sus consecuencias limitantes de toxicidad cardiorrespiratoria. Para el interrogatorio in vivo de ECG, mientras que los pacientes humanos nunca necesitan sedación, el pez cebra siempre requiere anestésicos o paralíticos, todos los cuales causan toxicidades cardiorrespiratorias variables.
En segundo lugar, la necesidad de asegurar los cables de ECG conectados eleva ligeramente la invasividad de un procedimiento no invasivo. Mientras que la colocación de plomo en el registro de ECG de superficie corporal en humanos es totalmente no invasiva porque los electrodos se adhieren a la epidermis humana, la colocación de plomo para el registro in vivo de ECG de peces cebra es más invasiva porque, como mínimo, los electrodos de acero deben perforar la piel del pez para una inserción segura en la musculatura del pez.
Las dos últimas limitaciones se derivan de las limitaciones anatómicas del pecho y el corazón del pez cebra. En tercer lugar, el tamaño minúsculo del corazón adulto del pez cebra requiere una reducción drástica en el número de cables de ECG. Mientras que los seres humanos acomodan fácilmente doce plomos en una grabación estándar de ECG, el pez cebra adulto normalmente puede acomodar sólo un solo cable unipolar o bipolar. La ramificación de un solo cable ECG es el desafío de optimizar simultáneamente las amplitudes de las tres ondas P, R y T. Por lo tanto, no se puede exagerar la importancia de una colocación óptima y precisa del plomo en el interrogatorio del ECG de peces cebra. En el pez cebra, la onda T presenta un desafío de detección único porque a menudo es la más pequeña de estas tres ondas. Por lo tanto, la amplitud de la onda T del pez cebra debe recibir prioridad de optimización sobre las ondas P y R típicamente más grandes.
En cuarto lugar, determinar el eje cardíaco principal del pez cebra para maximizar la amplitud de la onda R puede ser difícil. La razón es que el corazón del pez cebra tiene más libertad de movimiento dentro de su saco pericárdico suelto en comparación con el corazón humano dentro de su pericardio similar a un guante de forma.
En general, estas limitaciones estimularán la innovación futura de los métodos. Con la llegada de la impresión 3D y la electrónica deformable18, hay esperanza de implantación directa de plomo un día en despertar, alerta, nadar pez cebra utilizando un ‘cierre cardíaco’ de sensores de electrodos inalámbricos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R01 HL141452 a TPN. ADInstruments amablemente proporcionó una generosa financiación para sufragar el costo de la publicación de acceso abierto, pero no tenía ningún papel en el diseño experimental, la adquisición de datos, el análisis de datos de este estudio o cualquier acceso al manuscrito antes de su publicación.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |