ここでは、生きた麻酔を受けた成人ゼブラフィッシュの心電図を記録し、解釈するための、信頼性の高い、最小限に侵襲的で費用対効果の高い方法を提示する。
成体ゼブラフィッシュとヒトの心電図波形は著しく類似している。これらの心電図の類似性は、ヒト心臓電気生理学およびミオパシーの研究モデルとしてだけでなく、潜在的な心毒性に対する高スループット医薬品スクリーニングの代理モデルとしてもゼブラフィッシュの価値を高めるQT延長などの人間。このように、成体ゼブラフィッシュのための生体内心電図では、生体内電気生理学的特徴付けにおける断面または縦方向に必要な電気表現型ツールである。しかし、あまりにも多くの場合、信頼性が高く、実用的で費用対効果の高い記録方法の欠如は、生体内診断ツールがより容易にアクセスできるようになるのを防ぐ大きな課題のままです。ここでは、一貫性のある信頼性の高い記録を生み出す低メンテナンス、費用対効果、および包括的なシステムを使用して、成体ゼブラフィッシュの生体内心電図に対する実用的でわかりやすいアプローチについて説明します。生後12~18ヶ月の健康な成人男性ゼブラフィッシュを用いてプロトコルを例示する。また、心電図記録プロセスの早い段階でデータの正確性と堅牢性を確保するために、品質検証のための迅速なリアルタイム解釈戦略を導入しています。
ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)心臓は、オペルキュラムと胸郭の間の胸腔に対して前代々に位置する。心臓は銀色の心膜嚢の中でむしろゆるく囲まれています。解剖学的に、ゼブラフィッシュの心臓は、その小さなスケール(人間の心臓よりも100倍小さい)と1つの心室と1つの心室からなる2つのチャンバー構造のために、4チャンバの人間および他の哺乳類の心臓とは異なる。それにもかかわらず、心電図(ECG)波形と両種のQT間隔の持続時間は著しく類似している(図1)。したがって、ゼブラフィッシュは、ヒト遺伝性不整脈1、2、3および潜在的なヒト心毒性のハイスループット薬物スクリーニングのための人気モデルとして浮上している4、5QT 延長などです。
ヒトの心臓疾患のルーチン評価において、身体表面ECGは1903年にアイントホーフェンによって発明されて以来、最も広く使用されている第一線非侵襲的診断ツールとなっている。対照的に、2006年6月に成体ゼブラフィッシュの体表面ECG記録法を初めて適応し、その後7回の改変を行った結果、この技術は現場の多くの研究者にはほとんどアクセスできないままであった。この動物モデルの人気。成体ゼブラフィッシュの生体内ECG尋問を行った他の研究者のために、オペレータ間の広いバリエーションは、異なる研究からの心電図所見の矛盾につながった。一般的な理由は、面倒で高価な特殊なデバイスとソフトウェア、低信号対雑音比、電極配置に関する混乱を含み、成人ゼブラフィッシュECGの機能の不完全な理解によってさらに悪化し、基礎となる組織機構。生体内ECGが電気的に表現型ライブゼブラフィッシュの唯一の診断ツールであることを考えると、感度と特異性、再現性、アクセシビリティを向上させる標準化された方法が明らかに必要です。
ここでは、生体内心電図でゼブラフィッシュを記録し、解釈するための実用的で信頼性が高く、検証されたアプローチを提示します(図2)。前頭面の単一の双極性鉛を用いて、心電図波形の変化と生きた麻酔薬の健康な野生型AB成人ゼブラフィッシュの間隔持続時間を調べた。
本研究で実証したように、単一の鉛を用いて成体ゼブラフィッシュの生体内ECGで記録する場合、ECG記録結果の品質および妥当性に関する多くの注意事項がある。まず、適切な麻酔薬を選択し、必要最小限の麻酔濃度、深さ、持続時間を決定する際に、麻酔薬の心毒性と運動アーティファクトを抑制する重要な必要性とのバランスをとり、事前の決定を行います。生存と末端の実験計画。異なる薬物クラス5、14および麻痺剤1、6からの複数の麻酔薬の組み合わせの相乗的効力を利用して、個々の薬剤5または投与の用量を下げるより高い誘導用量に続く低い維持線量は典型的な戦略である。しかし、死亡8を含むそのよく知られた潜在的な心呼吸毒性にもかかわらず、トリカインはまだ最も広く使用され、利用可能な最良であり、ゼブラフィッシュのための米国食品医薬品局(FDA)によって承認された唯一の麻酔薬です。麻酔。トリカインは、単一の薬剤として、または他の麻酔薬や麻痺剤と組み合わせて、成人ゼブラフィッシュのECG記録で一般的に使用されています。
第二に、鉛配置精度は、正常な成虫ゼブラフィッシュECGの4つの検証基準を使用して、少なくとも健康な正常ゼブラフィッシュのために確保することができます。ここで提案する4つの検証基準のうち、最後の2つの基準は、通常のECG 5、7、15におけるR波の極性とT波の極性との間の基本的な一致を確認する。このRとT波の一致は、ヒト心臓の代理としてのゼブラフィッシュ心臓モデルの臨床的関連性に寄与するゼブラフィッシュとヒト16、17正常な心電図との間の、不運な、まだ重要な類似性である電気 生理 学。ただし、いくつかの良性または悪性の条件は、4 つの検証基準のいずれかを無効にする可能性があります。例えば、心筋虚血7、15ではR波とT波の一致が失われる。心筋虚血におけるR波とT波の一致のこの損失は、ゼブラフィッシュとヒト心電図の間のもう一つの顕著な類似性であり、ゼブラフィッシュ心筋梗塞モデルの臨床的関連性に寄与する。
最後に、ECG分析の標準的な実践をお勧めします。技術の出現によって、ECGの分析ソフトウェアは自動ECGの解釈を発生させることができる。しかし、我々は、訓練を受けた人間が常にECG記録につながるそれぞれの臨床シナリオに基づいて、すべての心電図を再解釈し、検証することを強くお勧めします。ECG分析ソフトウェアによる自動解釈のみに対する日常的な過度の依存は、特に一般的な正常なECG変異体、心臓病理、または最適でない鉛の配置の存在下では、お勧めできません。
この研究は、短い心電図記録セッションのための最小限に侵襲的な方法に焦点を当てています。しかし、長時間のECG記録セッションの持続時間に必要が生じた場合、連続灌流6による適切な酸素化、水和、麻酔を提供するために修正が必要である。
さらに、信号対雑音比を少なくとも 3 つの方法のいずれかで強化します。より強力なアンプを選択することは、多くの場合、実用的でない場合は、コストがかかります。体積導体を減らすために心膜嚢を開くことは合理的であるが、侵襲的であるが、7を採用したアプローチである。主心軸に平行な方向にリード軸を位置合わせする戦略的なリード配置(図4B)は、心電図電圧信号を最大化しますが、特に心膜検査がない場合は試行錯誤が必要になる場合があります。
ここで紹介した大人のゼブラフィッシュのための生体内ECGの尋問方法は、4つの主な利点を提供しています。まず、私たちの最小限に侵襲的なアプローチは、電極挿入のみを必要としますが、魚のスケール除去や胸部切除術はありません。したがって、魚の痛みを最小限に抑えることで、縦方向の生存研究で繰り返し心電図の尋問を可能にします。第二に、麻酔薬が魚の動きを十分に抑制すると、本研究の生体内ECG記録システムは、ノイズのない生信号で一貫して満足のいく信号対雑音比を生み出します。第3に、ここで提案する4つの基準品質検証は、ECGデータ取得の早い段階でデータの正確性と堅牢性を確保し、オペレータに依存する変動を最小限に抑えます。特に、最後の検証基準(通常のT波は直立している)は、ゼブラフィッシュ正常ECGの重要なヒト様特徴であるR波とT波の一致をカプセル化する(図1)。
しかし、我々のグループや他の人による成体ゼブラフィッシュのための生体内ECG方法論の現在に4つの主要な制限がまだ存在する。
第一に、被験者の協力の欠如は、その限定的な心呼吸毒性の結果と麻酔の必要性を必要とする。生体内ECGの尋問では、人間の患者が決して座り込み必要としないのに対し、ゼブラフィッシュは常に麻酔薬または麻痺を必要とし、そのすべてが可変的な心呼吸毒性を引き起こす。
第二に、取り付けられたECGリードを確保する必要性は、それ以外の場合は非侵襲的な手順の侵襲性をわずかに高める。ヒトの体表面ECG記録における鉛配置は、電極がヒト表皮に付着するため完全に非侵襲的であるのに対し、ゼブラフィッシュの生体内ECG記録における鉛配置は、最低限、鋼電極が必要であるため、より侵襲的である。魚の筋肉に安全に挿入するために魚の皮を穿刺する。
最後の2つの制限は、ゼブラフィッシュの胸と心臓の解剖学的制約に起因する。第三に、成虫ゼブラフィッシュ心臓の微小な大きさは、心電図リード数の劇的な減少を必要とする。人間は標準的なECG記録で12の鉛を容易に収容するが、成虫ゼブラフィッシュは通常、単一極または双極性鉛のみを収容することができる。単一のECGリードの影響は、3つのP波、R波、およびT波の振幅を同時に最適化する課題です。したがって、ゼブラフィッシュECGの尋問における最適で正確な鉛配置の重要性は誇張することはできません。ゼブラフィッシュでは、T波は、多くの場合、これらの3つの波の中で最も小さいため、ユニークな検出の課題を提示します。したがって、ゼブラフィッシュT波振幅は、典型的に大きなP波およびR波よりも最適化優先順位を受け取るべきである。
第4に、ゼブラフィッシュの主な心臓軸を決定してR波振幅を最大化することは困難でありうたえる。その理由は、ゼブラフィッシュの心臓は、その形態フィッティング手袋のような心膜内の人間の心臓と比較して、その緩い心膜嚢内の運動の自由度が高いからである。
全体として、これらの制限は、将来の方法の革新を刺激します。3Dプリンティングと変形可能なエレクトロニクス18の出現により、ワイヤレス電極センサの「心臓ソックス」を使用して、目覚め、警報、水泳ゼブラフィッシュで1日直接鉛注入の希望があります。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、TPNに国立衛生研究所R01 HL111452によってサポートされました.ADInstrumentsは、オープンアクセス公開のコストを削減するために寛大な資金を提供しましたが、実験的な設計、データ取得、本研究のデータ分析、または出版前の原稿へのアクセスに関しては何の役割もありませんでした。
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |