Hier presenteren we een betrouwbare, minimaal invasieve en kosteneffectieve methode om elektrocardiogrammen op te nemen en te interpreteren in levende verdoemde volwassen zebravis.
Het elektrocardiogram golfvormen van volwassen zebravis en die van de mens zijn opmerkelijk gelijkaardig. Deze gelijkenissen met elektrocardiogrammen versterken de waarde van zebravis niet alleen als een onderzoeksmodel voor menselijke cardiale elektrofysiologie en myopathieën, maar ook als surrogaat model in een hoge doorvoer van farmaceutische screening op mogelijke cardiotoxiciteiten mensen, zoals QT-verlenging. Als zodanig is in vivo elektrocardiografie voor volwassen zebravis een elektrisch fenotyping-instrument dat noodzakelijk, zo niet onmisbaar, is voor transversale of langsin vivo elektrofysiologische karakterisaties. Maar te vaak blijft het ontbreken van een betrouwbare, praktische en kosteneffectieve opnamemethode een belangrijke uitdaging om te voorkomen dat dit in vivo diagnostische instrument gemakkelijker toegankelijk wordt. Hier beschrijven we een praktische, eenvoudige benadering van in vivo elektrocardiografie voor volwassen zebravis met een onderhoudsarme, kosteneffectieve en uitgebreide systeem dat consistente, betrouwbare opnames oplevert. We illustreren ons protocol met behulp van gezonde volwassen mannelijke zebravis van 12-18 maanden oud. We introduceren ook een snelle real-time interpretatie strategie voor kwaliteits validatie om de nauwkeurigheid en robuustheid van gegevens vroegtijdig in het opnameproces van het elektrocardiogram te garanderen.
Het hart van de zebravissen (Danio rerio) ligt anteroventraal in de thoracische holte tussen de Operculum en de borst gordel. Het hart is vrij losjes ingesloten in een zilverkleurige pericardiale SAC. Anatomisch gezien is het zebravis hart verschillend van de vier-Chambered mens en andere zoogdier harten vanwege zijn verkleinde schaal (100-fold kleiner dan het menselijk hart) en zijn twee-Chambered structuur bestaande uit slechts één atrium en één ventrikel. Niettemin zijn de golfvormen van het elektrocardiogram (ECG) en de duur van het QT-interval van beide soorten opmerkelijk gelijkaardig (Figuur 1). Daarom is zebravis ontstaan als een populair model voor het bestuderen van menselijk geërfd aritmie1,2,3 en voor high-throughput drug screening van potentiële menselijke cardiotoxiteiten4,5 , zoals qt-verlenging.
Bij de routinematige evaluatie van menselijke hartziekten is het lichaam-oppervlakte ECG sinds de uitvinding door Einthoven in 1903 uitgegroeid tot het meest gebruikte eerste-regel niet-invasieve diagnose hulpmiddel. Aangezien de eerste aanpassing van de lichaamsoppervlakte ECG-opnamemethode voor volwassen zebravis in 20066 en enkele wijzigingen daarna7, is deze techniek echter grotendeels ontoegankelijk gebleven voor veel onderzoekers op het gebied, ondanks de populariteit van dit diermodel. Voor andere onderzoekers die in vivo ECG ondervraging voor volwassen zebravissen uitvoerde, leidden grote variaties tussen operatoren tot inconsistenties in ECG-bevindingen uit verschillende studies. Veelvoorkomende redenen zijn onder andere omslachtige en dure gespecialiseerde apparaten en software, lage signaal-ruis verhouding en verwarring over de plaatsing van de elektrode, alle verder verergerd door een onvolledig begrip van de volwassen zebravis ECG-functies en onderliggende weefsel mechanismen. Gezien het feit dat in vivo ECG het enige diagnostische instrument is voor elektrisch fenotype levende zebravis, is er een duidelijke behoefte aan een gestandaardiseerde methode om de gevoeligheid en specificiteit, reproduceerbaarheid en toegankelijkheid te verbeteren.
Hier presenteren we een praktische, betrouwbare en gevalideerde aanpak voor het opnemen en interpreteren van zebravis in vivo elektrocardiogrammen (Figuur 2). Met behulp van een enkele bipolaire lood in het frontale vlak, onderzochten we de veranderingen in ECG-golfvormen en interval duur van levende verdoemde gezonde wild-type AB volwassen zebravis.
Bij het opnemen in vivo ECG voor volwassen zebravis door middel van één lood zoals we in deze studie hebben aangetoond, zijn er een aantal kanttekeningen met betrekking tot de kwaliteit en geldigheid van de ECG-opnameresultaten. Ten eerste, bij het kiezen van de juiste anesthetica en het bepalen van de minimaal benodigde anesthesie concentratie, diepte, en duur, balanceren de anesthetische cardiotoxiciteit tegen de kritieke noodzaak om bewegings artefacten te onderdrukken en a priori bepaling voor een Survival versus een terminaal experimenteel ontwerp. Het kapitaliseren op de synergetische potentie van een combinatie van meerdere anesthetica van verschillende geneesmiddelen klassen 5,14 en paralytics1,6om de dosis van individuele agenten te verlagen5 of toedienen een lage onderhoudsdosis na een hogere inductie dosis zijn typische strategieën. Ondanks de bekende potentiële Cardiorespiratoire toxiciteiten, waaronder Death8, is tricaïne echter nog steeds de meest gebruikte, de best beschikbare, en de enige verdoving goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor zebravis Anesthesie. Tricaïne is in de volksmond gebruikt in ECG-opname van volwassen zebravis, hetzij als een enkele agent of in combinatie met andere anesthetica of verlamming.
Ten tweede kan de nauwkeurigheid van de lood plaatsing worden verzekerd ten minste voor gezonde normale zebravis met behulp van onze vier validerende criteria voor een normaal volwassen zebravis-ECG. Van de vier validerende criteria die wij hier voorstellen, bevestigen de laatste twee criteria samen de fundamentele concordantie tussen de polariteit van de R-golf en die van de T-golf in een normaal ECG5,7,15. Deze R-en T-golf concordantie is een toevallige, maar toch kritische gelijkenis tussen zebravis en humane16,17 normaal ECG dat bijdraagt aan de klinische relevantie van het zebravis hart model als surrogaat voor menselijke cardiale Elektrofysiologie. Verschillende goedaardige of kwaadaardige omstandigheden kunnen echter een van de vier validerende criteria ongeldig verklaren. De R-en T-golf concordantie gaat bijvoorbeeld verloren in myocardiale ischemie7,15. Dit verlies van R en T golf concordantie in myocardiale ischemie is een andere opvallende gelijkenis tussen zebravis en menselijk ECG dat bijdraagt aan de klinische relevantie van het zebravis myocardinfarct model.
Ten slotte bevelen we een standaard praktijk aan in ECG-analyse. Met de opkomst van technologie kan ECG-analyse software automatische ECG-interpretatie genereren. We raden echter sterk aan dat getrainde mensen altijd opnieuw moeten interpreteren en alle Ecg’s moeten verifiëren op basis van het respectieve klinische scenario dat leidt tot ECG-opname. Routine matige overafhankelijkheid uitsluitend op automatische interpretatie door een ECG-analyse software wordt afgeraden, met name in de aanwezigheid van gemeenschappelijke normale ECG-varianten, cardiale pathologieën of suboptimale lood plaatsing.
Deze studie richt zich op de minimaal invasieve methode voor korte ECG-opnamesessies. Echter, moet de noodzaak voor Terminal langdurige ECG opnamesessies uren duren, wijzigingen zijn nodig om voldoende oxygenatie, hydratatie, en anesthesie door continue perfusie6.
Verbeter bovendien de signaal-ruis verhouding met een van de ten minste drie manieren. Het kiezen van een krachtigere versterker is vaak een dure, zo niet onpraktische, optie. Het openen van de pericardiale SAC om de volume geleider te verminderen is een redelijke, hoewel invasieve, benadering die is aangenomen7. Strategische lead plaatsing om de lead-as uit te lijnen in een richting parallel aan de belangrijkste cardiale as (figuur 4b) zal de ECG-spannings signalen maximaliseren, maar kan trial and error vereisen, vooral bij afwezigheid van pericardiotomie.
De in vivo ECG ondervrachting voor volwassen zebravis die we hier hebben gepresenteerd, biedt vier belangrijke voordelen. Ten eerste, onze minimaal invasieve aanpak vereist alleen elektrode inbrengen, maar geen visschaal verwijdering of Thoracotomie-pericardiotomie. Daarom, door het minimaliseren van pijn voor de vis, onze aanpak maakt herhaalde ECG ondervragingen in longitudinale overleving studies. Ten tweede, wanneer anesthetica de beweging van de vissen adequaat onderdrukken, levert het in vivo ECG-opnamesysteem in onze studie consequent een bevredigende signaal-ruis verhouding met ruisvrije RAW-signalen. Ten derde, de vier-criterium kwaliteits validatie die wij hier voorstellen, waarborgt de nauwkeurigheid en robuustheid van gegevens in het begin van de ECG-gegevensverwerving en minimaliseert operator afhankelijke variaties. Tot slot omvat ons laatste validerende criterium (de normale T-golf is rechtop) de concordantie van de R-golf en T-golf, een belangrijk mensachtig kenmerk van zebravis normaal ECG (Figuur 1).
Er bestaan echter nog vier belangrijke beperkingen voor de huidige in vivo ECG-methodologie voor volwassen zebravis door onze groep en anderen.
Ten eerste vereist het gebrek aan samenwerking tussen de onderwerpen de noodzaak van anesthesie met de beperkende gevolgen voor de cardiorespiratoire toxiciteit. Voor in vivo ECG ondervraging, terwijl menselijke patiënten nooit sedatie nodig hebben, vereist zebravis altijd verdoving of verlamming, die allemaal een variabele Cardiorespiratoire toxiciteit veroorzaken.
Ten tweede, de noodzaak om de bijgevoegde ECG-leidingen te beveiligen licht verheft de invasiviteit van een anders niet-invasieve procedure. Overwegende dat lood plaatsing in de lichaamsoppervlakte ECG-opname van mensen volledig niet-invasief is omdat elektroden zich houden aan de menselijke epidermis, lood plaatsing voor in vivo ECG-opname van zebravis is meer invasief omdat, minimaal, stalen elektroden moeten Prik de visschil voor een veilige plaatsing in de visspieren.
De laatste twee beperkingen vloeien voort uit de anatomische beperkingen van de zebravis kist en het hart. Ten derde vereist de minuscule grootte van het volwassen zebravis hart een drastische vermindering van het aantal ECG-leads. Terwijl mensen gemakkelijk plaats bieden aan twaalf leads in een standaard ECG-opname, kan volwassen zebravis meestal slechts één unipolaire of bipolaire lead herbergen. De vertachting van een enkele ECG-lood is de uitdaging om gelijktijdig de amplitudes van alle drie de P, R, en T golven te optimaliseren. Daarom kan het belang van een optimale en accurate lood plaatsing in de zebravis ECG-ondervraging niet worden overschat. In zebravis presenteert de T Wave een unieke detectie uitdaging omdat het vaak de kleinste van deze drie golven is. Daarom moet de zebravis T Wave amplitude optimalisatie prioriteit krijgen over de meestal grotere P-en R-golven.
Ten vierde kan het bepalen van de zebravis belangrijkste cardiale as om de R-Golf amplitude te maximaliseren een uitdaging zijn. De reden hiervoor is dat het zebravis-hart meer bewegingsvrijheid heeft binnen zijn losse pericardiale SAC in vergelijking met het menselijk hart in zijn nauwsluitende handschoen-achtige pericardium.
Over het geheel genomen zullen deze beperkingen toekomstige methode-innovatie stimuleren. Met de komst van 3D-printen en vervormbare elektronica18, is er hoop voor directe lood implantatie op een dag in wakker, alert, zwemmen zebravis met behulp van een ‘ cardiale sok ‘ van draadloze elektrode sensoren.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health R01 HL141452 naar TPN. ADInstruments verleende vriendelijk genereuze financiering om de kosten van Open Access Publishing te bekostigen, maar had geen rol in experimenteel ontwerp, data-acquisitie, gegevensanalyse van deze studie of enige toegang tot het manuscript vóór publicatie.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |