Qui, presentiamo un metodo affidabile, minimamente invasivo e conveniente per registrare e interpretare gli elettrocardiogrammi nel pesce zebra adulto anestesizzato vivo.
Le forme d’onda dell’elettrocardiogramma del pesce zebra adulto e quelle degli esseri umani sono notevolmente simili. Queste somiglianze elettrocardiogramma migliorano il valore del pesce zebra non solo come modello di ricerca per l’elettrofisiologia e la miopatia cardiaca umana, ma anche come modello surrogato nello screening farmaceutico ad alto throughput per potenziali cardiotossicità esseri umani, come il prolungamento del QT. Come tale, l’elettrocardiografia in vivo per il pesce zebra adulto è uno strumento di fenotipizzazione elettrica che è necessario, se non indispensabile, per caratterizzazioni elettrofisiologiche in vivo trasversali o longitudinali. Tuttavia, troppo spesso, la mancanza di un metodo di registrazione affidabile, pratico ed economico rimane una sfida importante che impedisce a questo strumento diagnostico in vivo di diventare più facilmente accessibile. Qui descriviamo un approccio pratico e diretto all’elettrocardiografia in vivo per il pesce zebra adulto utilizzando un sistema a bassa manutenzione, conveniente e completo che produce registrazioni coerenti e affidabili. Illustriamo il nostro protocollo utilizzando pesci zebra maschi adulti sani di 12-18 mesi di età. Introduciamo anche una rapida strategia di interpretazione in tempo reale per la convalida della qualità per garantire l’accuratezza e la robustezza dei dati nelle prime fasi del processo di registrazione dell’elettrocardiogramma.
Il cuore di pesce zebra (Danio rerio) si trova anteroventrally alla cavità toracica tra l’opercolo e le cinture pettorali. Il cuore è racchiuso piuttosto liberamente all’interno di un sacco pericardico color argento. Anatomicamente, il cuore di pesce zebra è diverso dai cuori umani a quattro camere e altri mammiferi a causa della sua scala diminutiva (100 volte più piccola del cuore umano) e della sua struttura a due camere costituita da un solo atrio e un ventricolo. Ciò nonostante, le forme d’onda dell’elettrocardiogramma (ECG) e la durata dell’intervallo QT di entrambe le specie sono notevolmente simili (Figura 1). Di conseguenza, il pesce zebra è emerso come un modello popolare per studiare le aritmie ereditate umane1,2,3 e per lo screening farmacologico ad alto consumo di potenziali cardiotossicità umane4,5 , come il prolungamento del QT.
Nella valutazione di routine delle malattie cardiache umane, l’ECG della superficie corporea è diventato lo strumento diagnostico non invasivo di prima linea più utilizzato dalla sua invenzione da parte di Einthoven nel 1903. Al contrario, dal primo adattamento del metodo di registrazione ECG corpo-superficie per il pesce zebra adulto nel 20066 e diverse modifiche successivamente7, questa tecnica è rimasta in gran parte inaccessibile a molti ricercatori nel settore nonostante la popolarità di questo modello animale. Per altri ricercatori che hanno effettuato interrogatori ECG in vivo per il pesce zebra adulto, ampie variazioni tra gli operatori hanno portato a incoerenze nei risultati ECG da diversi studi. Le ragioni più comuni includono dispositivi e software specializzati ingombranti e costosi, basso rapporto segnale-rumore e confusione per quanto riguarda il posizionamento degli elettrodi, il tutto ulteriormente aggravato da una comprensione incompleta delle caratteristiche ECG del pesce zebra adulto e meccanismi tissutali sottostanti. Dato che l’ECG in vivo è l’unico strumento diagnostico per fenotipizzare elettricamente il pesce zebra vivo, vi è una chiara necessità di un metodo standardizzato per migliorare la sensibilità e la specificità, la riproducibilità e l’accessibilità.
Qui, presentiamo un approccio pratico, affidabile e convalidato per registrare e interpretare gli elettrocardiogrammi in vivo del pesce zebra (Figura 2). Utilizzando un singolo piombo bipolare nel piano frontale, abbiamo studiato i cambiamenti nelle forme d’onda ECG e le durate di intervallo del pesce zebra adulto AB di tipo selvatico sano anestesizzato sano.
Quando si registra ECG in vivo per il pesce zebra adulto per mezzo di un singolo lead, come abbiamo dimostrato in questo studio, ci sono una serie di avvertimenti sulla qualità e la validità dei risultati della registrazione ECG. In primo luogo, nella scelta degli anestetici appropriati e nel determinare la concentrazione minima dell’anestesia, della profondità e della durata, bilanciare le cardiotossicità anestetiche con la necessità critica di sopprimere gli artefatti di movimento e la determinazione preventiva per una progettazione sperimentale terminale. Sfruttando la potenza sinergica di una combinazione di anestetici multipli provenienti da diverse classi di farmaci5,14 e paralitici1,6 per abbassare la dose di singoli agenti5 o somministrazione una dose di bassa manutenzione che segue una dose di induzione più elevata sono strategie tipiche. Tuttavia, nonostante le sue ben note potenziali tossicità cardiorespiratorie, tra cui la morte8, la tricaina è ancora la più utilizzata, la migliore disponibile e l’unica anestetico approvata dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense per il pesce zebra Anestesia. La tricaina è stata popolarmente utilizzata nella registrazione ECG del pesce zebra adulto sia come singolo agente che in combinazione con altri anestetici o paralitici.
In secondo luogo, la precisione di posizionamento del piombo può essere garantita almeno per il pesce zebra normale sano utilizzando i nostri quattro criteri di convalida per un normale ECG di pesce zebra adulto. Dei quattro criteri di convalida che proponiamo qui, gli ultimi due criteri confermano insieme la concordanza fondamentale tra la polarità dell’onda R e quella dell’onda T in una normale ECG5,7,15. Questa concordanza delle onde R e T è una somiglianza fortuita, ma critica, tra il pesce zebra e l’uomo16,17 ECG normale che contribuisce alla rilevanza clinica del modello di cuore del pesce zebra come surrogato per il cuore umano Elettrofisiologia. Tuttavia, diverse condizioni benigne o maligne possono invalidare uno dei quattro criteri di convalida. Ad esempio, la concordanza delle onde R e T si perde nell’ischemia miopidea7,15. Questa perdita di concordanza delle onde R e T nell’ischemia miocardiale è un’altra sorprendente somiglianza tra il pesce zebra e l’ECG umano che contribuisce alla rilevanza clinica del modello di infarto miocardico del pesce zebra.
Infine, raccomandiamo una prassi standard nell’analisi ECG. Con l’avvento della tecnologia, il software di analisi ECG è in grado di generare un’interpretazione ECG automatica. Tuttavia, consigliamo vivamente che gli esseri umani addestrati reinterpretino e verifichino sempre tutti gli ECG in base al rispettivo scenario clinico che porta alla registrazione ECG. L’eccessiva dipendenza di routine esclusivamente dall’interpretazione automatica da parte di un software di analisi ECG è sconsigliabile, in particolare in presenza di comuni varianti ECG normali, patologie cardiache o posizionamento del piombo non ottimale.
Questo studio si concentra sul metodo minimamente invasivo per brevi sessioni di registrazione ECG. Tuttavia, in caso di necessità di sessioni di registrazione ECG prolungate terminali della durata di ore, sono necessarie modifiche per fornire un’adeguata ossigenazione, idratazione e anestesia mediante perfusione continua6.
Inoltre, migliorare il rapporto segnale-rumore di uno dei tre modi. La scelta di un amplificatore più potente è spesso un’opzione costosa, se non impraticabile. Aprire il sacco pericardio per ridurre il conduttore del volume è un approccio ragionevole, anche se invasivo, che è stato adottato7. Posizionamento strategico del piombo per allineare l’asse di piombo in una direzione parallela all’asse cardiaco principale (Figura 4B) massimizza i segnali di tensione ECG, ma può richiedere tentativi ed errori, soprattutto in assenza di pericardiotomia.
Il metodo di interrogatorio ECG in vivo per il pesce zebra adulto che abbiamo presentato qui offre quattro vantaggi principali. In primo luogo, il nostro approccio minimamente invasivo richiede solo l’inserimento di elettrodi, ma nessuna rimozione della scala di pesce o toracotomia-pericardiotomia. Pertanto, riducendo al minimo il dolore per i pesci, il nostro approccio consente ripetuti interrogatori ECG negli studi di sopravvivenza longitudinale. In secondo luogo, quando gli anestetici sopprimono adeguatamente il movimento dei pesci, il sistema di registrazione ECG in vivo nel nostro studio produce costantemente un rapporto segnale-rumore soddisfacente con segnali grezzi privi di rumore. In terzo luogo, la convalida della qualità a quattro criteri che proponiamo qui garantisce l’accuratezza e la robustezza dei dati nelle prime fasi dell’acquisizione dei dati ECG e riduce al minimo le variazioni dipendenti dall’operatore. Infine, in particolare, il nostro ultimo criterio di convalida (l’onda T normale è verticale) incapsula la concordanza dell’onda R e dell’onda T, un’importante caratteristica umana del normale ECG (Figura 1).
Tuttavia, esistono ancora quattro limitazioni principali all’attuale metodologia ECG in vivo per il pesce zebra adulto da parte del nostro gruppo e di altri.
In primo luogo, la mancanza di cooperazione in materia richiede la necessità di anestesia con le sue limitazioni delle conseguenze di tossicità cardiorespiratoria. Per l’interrogatorio ECG in vivo, mentre i pazienti umani non hanno mai bisogno di sedazione, il pesce zebra ha sempre bisogno di anestetici o paralitici, che causano tossicità cardiorespiratorie variabili.
In secondo luogo, la necessità di garantire i cavi ECG collegati eleva leggermente l’invasività di una procedura altrimenti non invasiva. Mentre il posizionamento del piombo nella registrazione ECG del corpo-superficie dell’uomo è del tutto non invasivo perché gli elettrodi aderiscono all’epidermide umana, il posizionamento del piombo per la registrazione ECG in vivo del pesce zebra è più invasivo perché, come minimo, gli elettrodi in acciaio devono forare la pelle del pesce per l’inserimento sicuro nella muscolatura di pesce.
Le ultime due limitazioni derivano dai vincoli anatomici del petto e del cuore del pesce zebra. In terzo luogo, la dimensione minuscola del cuore di pesce zebra adulto richiede una drastica riduzione del numero di cavi ECG. Mentre gli esseri umani ospitano prontamente dodici cavi in una registrazione ECG standard, il pesce zebra adulto può in genere ospitare solo un singolo piombo unipolare o bipolare. La ramificazione di un singolo cavo ECG è la sfida per ottimizzare contemporaneamente le ampiezza di tutte e tre le onde P, R e T. Pertanto, l’importanza di un posizionamento ottimale e accurato del piombo nell’interrogatorio ECG del pesce zebra non può essere sopravvalutata. Nel pesce zebra, l’onda T presenta una sfida di rilevamento unica perché è spesso la più piccola di queste tre onde. Pertanto, l’ampiezza delle onde T del pesce zebra dovrebbe ricevere la priorità di ottimizzazione sulle onde P e R tipicamente più grandi.
Quarto, determinare l’asse cardiaco principale del pesce zebra per massimizzare l’ampiezza dell’onda R può essere difficile. La ragione è che il cuore del pesce zebra ha più libertà di movimento all’interno del suo sacco pericardico sciolto rispetto al cuore umano all’interno del suo pericardio simile a un guanto.
Nel complesso, queste limitazioni stimoleranno l’innovazione dei metodi futuri. Con l’avvento della stampa 3D e dell’elettronica deformabile18,c’è speranza per l’impianto diretto del piombo un giorno in veglia, vigile, pesce zebra nuoto utilizzando un ‘calzino cardiaco’ di sensori di elettrodi wireless.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dai National Institutes of Health R01 HL141452 a TPN. ADInstruments ha gentilmente fornito generosi finanziamenti per coprire il costo dell’editoria ad accesso aperto, ma non ha avuto alcun ruolo nella progettazione sperimentale, nell’acquisizione dei dati, nell’analisi dei dati di questo studio o nell’accesso al manoscritto prima della pubblicazione.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |