여기에서, 우리는 살아있는 마취된 성숙한 얼룩말어에 있는 심전도를 기록하고 해석하는 믿을 수 있고, 최소침습, 비용 효과적인 방법을 제시합니다.
성인 얼룩말물고기와 인간의 심전도 파형은 현저하게 유사합니다. 이러한 심전도 유사성은 인간의 심장 전기 생리학 및 근병증에 대한 연구 모델뿐만 아니라 잠재적 인 심장 독성에 대한 높은 처리량 제약 스크리닝의 대리 모델로제브라피쉬의 가치를 향상시킵니다. QT 연장과 같은 인간. 이와 같이, 성인 제브라피시에 대한 생체 내 심전도는 생체 내 전기 생리학적 특성화에서 단면 또는 세로에 필수적이지 않은 경우 필요한 전기 표현형 도구이다. 그러나, 너무 자주, 신뢰할 수 있는, 실용적인, 그리고 비용 효율적인 기록 방법의 부족 이 생체 내 진단 도구더 쉽게 액세스할 수 없게 하는 주요 도전 남아. 여기서는 일관되고 신뢰할 수 있는 기록을 생성하는 낮은 유지 보수, 비용 효율적이고 포괄적인 시스템을 사용하여 성인 제브라피시를 위한 생체 내 심전도에 대한 실용적이고 간단한 접근 방식을 설명합니다. 우리는 생후 12-18개월의 건강한 성인 남성 얼룩말어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 또한 심전도 기록 프로세스 초기에 데이터 정확성과 견고성을 보장하기 위해 품질 검증을 위한 신속한 실시간 해석 전략을 도입했습니다.
제브라피시(Daniorerio)심장은 피퍼럼과 가슴 거들 사이의 흉강으로 전방에 위치한다. 마음은 은색 의 회낭 안에 오히려 느슨하게 둘러싸여 있습니다. 해부학적으로, 제브라피쉬 심장은 작은 규모 (인간의 심장보다 100 배 작은)와 하나의 심방과 하나의 심실로 구성된 2 개의 챔버 구조로 인해 4 챔버 인간 및 기타 포유류 심장과 다릅니다. 그럼에도 불구하고, 심전도(ECG) 파형 및 두 종의 QT 간격의지속 기간은 현저하게 유사하다(도 1). 이에 따라, 제브라피쉬는 인간 상속 부정맥 1,2,3 및 잠재적 인 인간 심장 독성의 고처리량 약물 스크리닝을 위한 인기있는 모델로 부상하고있다 4,5 QT 연장과 같은.
인간의 심장 질환의 일상적인 평가에서, 신체 표면 심전도는 1903 년에 아인토벤에 의해 발명 된 이후 가장 광범위하게 사용되는 첫 번째 라인 비 침습적 진단 도구가되었다. 대조적으로, 2006년 6년 6년 성체 얼룩말어에 대한 체표면 심전도 기록 방법의 첫 번째 적응 이후,이기술은 현장에서 많은 연구자들이 접근할 수 없는 상태로 남아 있다. 이 동물 모델의 인기. 성인 얼룩말물고기에 대한 생체 내 심전도 심문을 수행 한 다른 연구원의 경우, 운영자 들 간의 넓은 변화는 다른 연구에서 심전도 발견의 불일치로 이어졌다. 일반적인 이유는 성가신 고가의 특수 장치 및 소프트웨어, 낮은 신호 대 잡음 비율, 전극 배치에 대한 혼란, 성인 제브라피시 ECG 기능의 불완전한 이해에 의해 더욱 악화 및 기본 조직 메커니즘. 생체 내 심전도가 전기적으로 표현형 살아있는 얼룩말어에 유일한 진단 도구임을 감안할 때, 감도 및 특이성, 재현성 및 접근성을 개선하기 위한 표준화된 방법에 대한 명확한 필요성이 있습니다.
여기서, 우리는 생체 내 심전도에서 제브라피시를 기록하고 해석하기 위한실용적이고 신뢰할 수 있고 검증된 접근법을 제시합니다(그림 2). 정면 평면에서 단일 양극성 리드를 사용하여, 우리는 살아있는 마취 건강한 야생 형 AB 성인 얼룩말피의 심전도 파형 및 간격 기간의 변화를 조사했다.
이 연구에서 입증한 바와 같이 단일 리드를 통해 성인 제브라피시에 대한 생체 내 심전도를 기록할 때, 심전도 기록 결과의 품질 및 유효성에 관한 많은 주의 사항이 있습니다. 첫째, 적절한 마취제를 선택하고 필요한 최소한의 마취 농도, 깊이 및 기간을 결정할 때, 마취 심독성과 운동 아티팩트를 억제하는 중요한 필요성 및 선험적 결정을 결정하는 데 있습니다. 생존 대 말단 실험 설계. 상이한 약물 클래스5,14 및 마비제1,6에서 여러 마취제의 조합의 상승 효능을 활용하여 개별 제제5 또는 투여의 용량을 낮춥니다. 더 높은 유도 복용량다음 낮은 유지 보수 복용량은 전형적인 전략. 그러나, 죽음을 포함하여 그것의 잘 알려진 잠재적인심장 호흡 독성에도 불구하고 8, 트리카인은 아직도 가장 널리 이용되고, 제브라피시(FDA)에 대한 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된 유일한 마취제입니다. 마 취. 트리카인은 단일 제제 또는 다른 마취제 또는 마비와 함께 성인 제브라피시의 심전도 기록에 널리 사용되어 왔습니다.
둘째, 일반 성인용 제브라피시 심전도에 대한 네 가지 검증 기준을 사용하여 건강한 정상 제브라피시에 대해 적어도 납 배치 정확도를 보장할 수 있습니다. 여기서 제안하는 4가지 검증 기준 중, 마지막 두 가지 기준은 함께 정상 심전도 5,7,15에서R파의 극성과 T파의 극성 사이의 근본적인 일치를 확인한다. 이 R 및 T 웨이브 일치는 인간 심장에 대한 대리로 제브라피시 심장 모델의 임상 적 관련성에 기여하는 제브라피쉬와 인간16,17 정상 심전도 사이의 운이, 아직 중요한 유사성입니다. 전기 생리학. 그러나, 몇몇 양성 또는 악성 조건은 4개의 검증 기준 중 어느 것을 무효화할 수 있습니다. 예를 들어, R 및 T 파의 일치는 심근허혈 7,15에서손실됩니다. 심근 허혈에서 R 및 T 파 의 일치의 이 손실은 제브라피시 심근 경색 모형의 임상 관련성에 기여하는 zebrafish와 인간 심전도 사이 또 다른 눈에 띄는 유사입니다.
마지막으로, 심전도 분석에서 표준 사례를 권장합니다. 기술의 출현으로 ECG 분석 소프트웨어는 자동 심전도 해석을 생성할 수 있습니다. 그러나, 우리는 강하게 훈련된 인간은 항상 ECG 기록으로 이끌어 내는 각각의 임상 시나리오에 근거를 둔 모든 ECGs를 재해석하고 확인해야 한다는 것을 추천합니다. ECG 분석 소프트웨어에 의한 자동 해석에 대한 일상적인 과의존은 특히 일반적인 정상적인 심전도 변이체, 심장 병리 또는 최적이 아닌 납 배치가 있는 경우 바람직하지 않습니다.
이 연구는 간단한 심전도 기록 세션을 위한 최소 침습 방법에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 말단 장기간 심전도 기록 세션에 대한 필요성이 발생하는 경우, 연속 관류 6에 의한 적절한산소화, 수화 및 마취를 제공하기 위해 수정이 필요하다.
또한 신호 대 잡음 비율을 세 가지 방법 중 하나이상 향상시킵니다. 더 강력한 앰프를 선택하는 것은 종종 비실용적이지 않은 경우 비용이 많이 드는 옵션입니다. 볼륨 컨덕토리를 줄이기 위해 심낭을 여는 것은 7을 채택한침습적이지만 합리적인 접근 방식입니다. 주요 심장 축에 평행한 방향으로 리드 축을 정렬하는 전략적 리드 배치 (그림4B)는심전도 전압 신호를 최대화하지만 특히 심근 절제술이없는 경우 시행 착오가 필요할 수 있습니다.
우리가 여기에서 제시한 성인 얼룩말 물고기를 위한 생체 내 ECG 심문 방법은 4개의 주요 이점을 제안합니다. 첫째, 우리의 최소 침습 적 접근법은 전극 삽입만 필요하지만 물고기 스케일 제거 또는 흉부 절제술은 필요하지 않습니다. 따라서, 물고기에 대한 통증을 최소화함으로써, 우리의 접근 방식은 종방향 생존 연구에서 반복 된 심전도 심문을 가능하게합니다. 둘째, 마취제가 물고기의 움직임을 적절히 억제할 때, 당사의 연구에서 생체 내 심전도 기록 시스템은 지속적으로 무소음 원시 신호로 만족스러운 신호 대 잡음 비를 산출합니다. 셋째, 여기에서 제안하는 4가지 기준 품질 검증은 ECG 데이터 수집 초기에 데이터 정확성과 견고성을 보장하고 운영자에 대한 변동을 최소화합니다. 마지막으로, 우리의 마지막 검증 기준(정상 T파는 수직)은 제브라피시 정상 심전도의 중요한 인간과 같은 특징인 R파와 T파의 일치를캡슐화합니다(그림 1).
그러나, 여전히 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 성인 얼룩말 물고기에 대 한 생체 내 ECG 방법론에 4 개의 주요 제한 사항이 존재.
첫째, 주제 협력의 부족은 그것의 제한적인 심호흡 독성 결과로 마취를 위한 필요를 필요로 합니다. 생체 내 심전도 심문을 위해, 인간 환자는 결코 과실을 필요로 하지 않는 반면, zebrafish는 항상 마취제 또는 마비를 필요로 하며, 이 모든 것은 가변적인 심폐 독성을 유발합니다.
둘째, 부착 된 심전도 리드를 고정 할 필요성은 그렇지 않으면 비 침습적 절차의 침략성을 약간 상승시킵니다. 인간의 신체 표면 심전도 기록에 납 배치는 전극이 인간의 표피에 부착하기 때문에 전적으로 비 침습적이지만, 제브라피시의 생체 내 심전도 기록에 대한 리드 배치는 최소한 강철 전극이 있어야하기 때문에 더 침습적입니다. 물고기 근육에 안전한 삽입을 위해 물고기 피부를 뚫습니다.
마지막 두 가지 제한은 제브라피시 가슴과 심장의 해부학적 제약에서 비롯됩니다. 셋째, 성인 제브라피시 심장의 작은 크기는 심전도 리드의 수의 급격한 감소를 필요로한다. 인간은 표준 심전도 기록에서 12개의 리드를 쉽게 수용하지만, 성인용 제브라피쉬는 일반적으로 단극성 또는 양극성 납 하나만 수용할 수 있습니다. 단일 ECG 리드의 파급 효과는 세 가지 P, R 및 T 파의 진폭을 동시에 최적화하는 과제입니다. 따라서 zebrafish ECG 심문에서 최적이고 정확한 리드 배치의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 제브라피시에서 T웨이브는 이 세 가지 파도 중 가장 작은 파도이기 때문에 독특한 검출 과제를 제시합니다. 따라서, 제브라피쉬 T파진폭은 통상적으로 더 큰 P 및 R파에 비해 최적화 우선순위를 받아야 한다.
넷째, R파진폭을 최대화하기 위해 제브라피쉬 주 심장축을 결정하는 것은 어려울 수 있다. 그 이유는 제브라피쉬 심장이 형태에 맞는 장갑과 같은 심낭 내의 인간의 심장에 비해 느슨한 심낭 내에서 더 많은 움직임을 가지고 있다는 것입니다.
전반적으로, 이러한 제한은 미래의 방법 혁신을 자극할 것입니다. 3D 프린팅과 변형 가능한 전자 장치18의출현으로 무선 전극 센서의 ‘심장 양말’을 사용하여 제브라피시를 깨우고, 경고하고, 수영하는 첫 날에 직접 납 이식에 대한 희망이 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 TPN에 건강 R01 HL141452의 국가 학회에 의해 지원되었다. ADInstruments 친절 하게 오픈 액세스 게시의 비용을 무시 하기 위해 관대 한 자금을 제공 하지만 실험 디자인, 데이터 수집, 이 연구의 데이터 분석 또는 출판 하기 전에 원고에 대 한 액세스에 아무 역할.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |