Her presenterer vi en pålitelig, minimalt invasiv og kostnadseffektiv metode for å registrere og tolke elektrokardiogrammer i live anesthetized voksen sebrafisk.
Elektro bølgeformer av voksne sebrafisk og de av mennesker er bemerkelsesverdig lik. Disse elektro likheter øke verdien av sebrafisk ikke bare som en forsknings modell for menneskelig CARDIAC elektrofysiologi og myopatier men også som et surrogat modell i høy gjennomstrømning farmasøytiske screening for potensielle cardiotoxicities til mennesker, slik som QT-forlengelse. Som sådan, in vivo elektrokardiografi for voksen sebrafisk er et elektrisk bestemmelse av fenotype verktøy som er nødvendig, om ikke uunnværlig, for tverrsnitt eller langsgående in vivo elektrofysiologisk characterizations. Men for ofte er mangelen på en pålitelig, praktisk og kostnadseffektiv opptaks metode fortsatt en stor utfordring å hindre at dette in vivo diagnostisk verktøy blir lettere tilgjengelig. Her beskriver vi en praktisk, grei tilnærming til in vivo elektrokardiografi for voksne sebrafisk ved hjelp av et lite vedlikehold, kostnadseffektivt og omfattende system som gir konsistente, pålitelige innspillinger. Vi illustrerer vår protokoll ved hjelp av sunne voksne mannlige sebrafisk av 12-18 måneders alder. Vi introduserer også en rask tolknings strategi i sanntid for kvalitets validering for å sikre data nøyaktighet og robusthet tidlig i elektro opptaksprosessen.
Sebrafisk (Danio rerio) hjerte ligger anteroventrally til bryst hulen mellom Operculum og pectoral hofteholdere. Hjertet er vedlagt ganske løst i en sølv-farget perikard SAC. Anatomisk er sebrafisk hjerte forskjellig fra de fire-kamret menneske og andre pattedyr hjerter på grunn av sin lille skala (100-fold mindre enn menneskets hjerte) og dens to-kamret struktur bestående av bare ett Atrium og en ventrikkel. Likevel, elektro (EKG) bølgeformer og varigheten av QT-intervallet av begge artene er bemerkelsesverdig lik (figur 1). Følgelig har sebrafisk dukket opp som en populær modell for å studere menneskelig arvet arytmi1,2,3 og for høy gjennomstrømming narkotika screening av potensielle menneskelige cardiotoxicities4,5 , for eksempel QT-forlengelse.
I rutinemessig evaluering av menneskelige hjertesykdommer, har kroppen-overflaten EKG blitt den mest utbredte brukte første-linjen ikke-invasiv diagnostisk verktøy siden oppfinnelsen av Einthoven i 1903. I kontrast, siden den første tilpasningen av kroppen-overflaten EKG-opptak metode for voksne sebrafisk i 20066 og flere modifikasjoner deretter7, denne teknikken har vært stort sett utilgjengelige for mange forskere i feltet til tross populariteten til denne dyre modellen. For andre forskere som utførte in vivo ECG-avhør for voksne sebrafisk, førte store variasjoner blant operatørene til inkonsekvens i EKG-funn fra ulike studier. Vanlige årsaker inkluderer tungvint og dyre spesialiserte enheter og programvare, lav signal-til-støy-forhold, og forvirring om elektrodeplassering, alle ytterligere forverret av en ufullstendig forståelse av den voksne sebrafisk EKG-funksjoner og underliggende vevs mekanismer. Gitt at in vivo ECG er det eneste diagnostiske verktøyet for elektrisk fenotype av levende sebrafisk, er det et klart behov for en standardisert metode for å forbedre følsomhet og spesifisitet, reproduserbarhet og tilgjengelighet.
Her presenterer vi en praktisk, pålitelig og validert tilnærming for å registrere og tolke sebrafisk in vivo-elektrokardiogrammer (figur 2). Ved hjelp av en enkelt bipolar bly i frontal flyet, undersøkte vi endringene i EKG bølgeformer og intervall varighet av levende anesthetized sunn vill-type AB voksen sebrafisk.
Når du registrerer in vivo ECG for voksen sebrafisk ved hjelp av et enkelt bly som vi har vist i denne studien, er det en rekke advarsler om kvaliteten og gyldigheten av resultatene av EKG-opptaket. Først i valg av riktige anestesi og bestemme minimal nødvendig anestesi konsentrasjon, dybde og varighet, balansere bedøvelse cardiotoxicities mot kritiske behovet for å undertrykke bevegelse gjenstander og a priori bestemmelse for en overlevelse g. Terminal eksperimentell design. Utnytte synergi styrken av en kombinasjon av flere bedøvelse fra ulike legemiddel klasser5,14 og paralytics for å senke dosen av individuelle agenter5 eller administrere en lav vedlikeholdsdose etter en høyere induksjon dose er typiske strategier. Men til tross for sin velkjente potensielle cardiorespiratory toksisitet, inkludert død8, er tricaine fortsatt den mest brukte, den beste tilgjengelige, og den eneste anestesi godkjent av US Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) for sebrafisk Anestesi. Tricaine har blitt populært brukt i EKG-opptak av voksne sebrafisk enten som en enkelt agent eller i kombinasjon med andre anestesi eller paralytics.
Sekund, bly plassering nøyaktighet kan sikres minst for sunn normal sebrafisk bruke våre fire validere kriterier for en normal voksen sebrafisk EKG. Av de fire validere kriteriene som vi foreslår her, de to siste kriteriene sammen bekrefter de grunnleggende samsvarskravene mellom polariteten til R-bølgen og T-bølgen i en normal EKG5,7,15. Denne R og T Wave-kon kor sen er en tilfeldig, men likevel kritisk, likhet mellom sebrafisk og humant16,17 normal EKG som bidrar til den kliniske relevansen av sebrafisk hjerte modell som et surrogat for menneskers hjerte elektrofysiologi. Imidlertid kan flere godartet eller ondartede tilstander oppheve noen av de fire valideringskriteriene. For eksempel er R og T Wave konkordans tapt i hjerteinfarkt iskemi7,15. Dette tapet av R og T bølge kon kor sen i hjerteinfarkt iskemi er en annen slående likhet mellom sebrafisk og menneskelige EKG som bidrar til klinisk relevans av sebrafisk hjerteinfarkt modellen.
Til slutt anbefaler vi en standard praksis i EKG-analyse. Med bruk av teknologi kan EKG-analyseprogramvare generere automatisk EKG-tolkning. Vi anbefaler imidlertid på det sterkeste at utdannede mennesker alltid skal tolke og verifisere alle EKG basert på det respektive kliniske scenarioet som fører til EKG-opptak. Rutinemessig selvhjulpenhet utelukkende på automatisk tolkning av en EKG analyseprogramvare er utilrådelig, spesielt i nærvær av vanlige normale EKG-varianter, CARDIAC patologi, eller suboptimal bly plassering.
Denne studien fokuserer på den minimalt invasiv metode for korte EKG-opptak økter. Men skulle behovet oppstå for Terminal langvarig EKG-opptak økter varige timer, modifikasjoner er nødvendig for å gi tilstrekkelig oksygenering, hydrering og anestesi ved kontinuerlig å få6.
I tillegg forsterke signal-til-støy-forhold med en av minst tre måter. Velge en kraftigere forsterker er ofte en kostbar, om ikke upraktisk, alternativ. Åpning av perikard SAC å redusere volumet dirigent er en rimelig, men invasiv, tilnærming som har blitt vedtatt7. Strategisk bly plassering for å justere ledelsen aksen i en retning parallelt med de viktigste CARDIAC aksen (figur 4b) vil maksimere EKG spennings signaler, men kan kreve prøving og feiling, spesielt i fravær av pericardiotomy.
The in vivo EKG avhør metode for voksne sebrafisk som vi presenterte her tilbyr fire viktigste fordelene. Først, vår minimalt invasiv tilnærming krever bare elektrode innsetting, men ingen fisk skala fjerning eller toraktomi-pericardiotomy. Derfor, ved å minimere smerte for fisken, muliggjør vår tilnærming gjentatte EKG-avhør i langsgående overlevelses studier. For det andre, når anestesi tilstrekkelig undertrykke fisken bevegelse, i vivo EKG innspillingen system i vår studie gir konsekvent et tilfredsstillende signal-til-støy-forhold med støy frie rå signaler. For det tredje sørger den fire-kriteriet kvalitets godkjenningen som vi foreslår her, data nøyaktighet og robusthet tidlig i EKG datainnsamlingen og minimerer operatør avhengige variasjoner. Endelig, i særdeleshet, vår siste validering kriterium (normal T-bølgen er oppreist) omslutter kon kor ringen av R-bølgen og T-bølgen, en viktig menneske-lignende funksjon i sebrafisk normal EKG (figur 1).
Det finnes imidlertid fortsatt fire store begrensninger for gjeldende in vivo ECG-metodikk for voksne som er sebrafisk av vår gruppe og andre.
For det første nødvendiggjør mangelen på samarbeid behovet for anestesi med sine begrensende cardiorespiratory toksisitet konsekvenser. For in vivo EKG avhør, mens menneskelige pasienter aldri trenger sedasjon, sebrafisk alltid krever anestesi eller paralytics, som alle forårsake variable cardiorespiratory toksisitet.
For det andre, behovet for å feste det vedlagte EKG fører litt løfter invasiveness av en ellers ikke-invasiv prosedyre. Mens bly plassering i kroppen-overflaten EKG-opptak av mennesker er helt ikke-invasiv fordi elektroder holder seg til den menneskelige epidermis, bly plassering for in vivo EKG-opptak av sebrafisk er mer invasiv fordi, på minimum, stål elektroder må punktering av fisken huden for sikker innsetting i fisken muskulaturen.
De to siste begrensningene stammer fra de anatomiske begrensningene i sebrafisk bryst og hjerte. For det tredje nødvendiggjør den ørsmå størrelsen på det voksne sebrafisk hjertet en drastisk reduksjon i antall EKG-avledninger. Mens mennesker lett imøtekomme tolv fører i et standard EKG-opptak, voksen sebrafisk kan vanligvis romme bare en enkelt Unipolare eller bipolar bly. Forgreninger av et enkelt EKG-bly er utfordringen å optimalisere samtidig amplituder av alle tre P, R, og T bølger. Betydningen av optimal og nøyaktig plassering av bly i sebrafisk EKG-avhør kan derfor ikke være overdrevet. I sebrafisk, den T bølgen presenterer en unik oppdagelse utfordring fordi det er ofte den minste av disse tre bølgene. Derfor bør den sebrafisk T-bølgen amplitude få optimaliserings prioritet over de vanligvis større P-og R-bølgene.
Fjerde, bestemme sebrafisk viktigste CARDIAC aksen for å maksimere R bølge amplitude kan være utfordrende. Årsaken er at sebrafisk hjertet har mer bevegelsesfrihet innenfor sin løs perikard sac i forhold til menneskets hjerte innenfor sin form-montering hanske-lignende pericardium.
Overall, disse begrensningene vil stimulere fremtidig metode innovasjon. Med bruk av 3D-utskrift og deformerbare elektronikk18, det er håp for direkte bly implantation en dag i våken, våken, svømming sebrafisk ved hjelp av en “CARDIAC sokk” av trådløse elektrode sensorer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health R01 HL141452 til TPN. ADInstruments vennlige gitt generøse midler til å dekke kostnadene ved åpen tilgang publisering, men hadde ingen rolle i enten eksperimentell design, datainnsamling, dataanalyse av denne studien eller tilgang til manuskriptet før publisering.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |