Aqui, apresentamos um método confiável, minimamente invasivo e econômico para registrar e interpretar eletrocardiogramas em zebrafish adulto anestesiado ao vivo.
As formas de onda do electrocardiograma do zebrafish adulto e daquelas dos seres humanos são notàvelmente similares. Estas similaridades do electrocardiograma aumentam o valor do zebrafish não somente como um modelo da pesquisa para a electrofisiologia e os miopatias cardíacos humanos mas igualmente como um modelo substituto no exame farmacêutico da taxa de transferência elevada para cardiotoxicities potenciais a humanos, como prolongamento do intervalo QT. Como tal, a eletrocardiografia in vivo para o zebrafish adulto é uma ferramenta de fenotipagem elétrica que é necessária, se não indispensável, para caracterizações eletrofisiológicas transversais ou longitudinais in vivo. No entanto, com demasiada frequência, a falta de um método de gravação fiável, prático e rentável continua a ser um grande desafio que impede esta ferramenta de diagnóstico in vivo de se tornar mais prontamente acessível. Aqui, descrevemos uma abordagem prática e direta para a eletrocardiografia in vivo para o zebrafish adulto usando um sistema de baixa manutenção, econômico e abrangente que produz gravações consistentes e confiáveis. Nós ilustramos nosso protocolo usando o zebrafish masculino adulto saudável de 12-18 meses da idade. Também apresentamos uma estratégia de interpretação rápida em tempo real para validação de qualidade para garantir a precisão dos dados e robustez no início do processo de gravação do eletrocardiograma.
O coração do zebrafish (Danio rerio) é localizado anteroventrally à cavidade torácica entre o opérculo e as cintas peitorais. O coração é fechado rather frouxamente dentro de um saco pericárdico Silver-colored. Anatomicamente, o coração zebrafish é diferente dos quatro-sepados humanos e outros corações de mamíferos por causa de sua escala diminutiva (100 vezes menor do que o coração humano) e sua estrutura de duas câmaras consistindo de apenas um átrio e um ventrículo. No entanto, as formas de onda do eletrocardiograma (ECG) e a duração do intervalo QT de ambas as espécies são notavelmente semelhantes (Figura 1). Assim, o zebrafish surgiu como um modelo popular para o estudo de arritmias hereditárias humanas1,2,3 e para a triagem de medicamentos de alta produtividade de potenciais carditoxicidades humanas4,5 , como prolongamento do intervalo QT.
Na avaliação rotineira de doenças cardíacas humanas, o ECG da corpo-superfície transformou-se a ferramenta diagnóstica não invasora de primeira linha o mais extensivamente usada desde sua invenção por Einthoven em 1903. Em contraste, desde a primeira adaptação do método de gravação de ECG do corpo-superfície para o zebrafish adulto em 20066 e diversas modificações depois disso7, esta técnica remanesceu pela maior parte inacessível a muitos investigadores no campo apesar a popularidade deste modelo animal. Para outros pesquisadores que realizaram a interrogação in vivo de ECG para o zebrafish adulto, as variações largas entre operadores conduziram à inconsistência em resultados de ECG dos estudos diferentes. As razões comuns incluem os dispositivos e o software especializados complicados e caros, a baixa relação do sinal-à-ruído, e a confusão a respeito da colocação do elétrodo, tudo agravado ainda por uma compreensão incompleta das características adultas do ECG do zebrafish e mecanismos de tecido subjacente. Tendo em conta que o ECG in vivo é a única ferramenta diagnóstica para o fenótipo de zebrafish vivo, há uma clara necessidade de um método padronizado para melhorar a sensibilidade e especificidade, reprodutibilidade e acessibilidade.
Aqui, apresentamos uma abordagem prática, confiável e validada para registrar e interpretar os eletrocardiogramas de zebrafish in vivo (Figura 2). Usando uma única ligação bipolar no plano frontal, nós investigamos as mudanças em formas de onda de ECG e durações do intervalo de zebrafish saudável do selvagem-tipo sadio anestesiado vivo de AB do adulto.
Ao registrar o ECG in vivo para o zebrafish adulto por meio de uma única ligação como nós demonstramos neste estudo, há um número de advertências a respeito da qualidade e da validez dos resultados do registro de ECG. Em primeiro lugar, ao escolher os anestésicos apropriados e determinar a concentração mínima necessária de anestesia, profundidade e duração, equilibrar as cardiotoxidades anestésicas contra a necessidade crítica de suprimir artefatos de movimento e a determinação a priori para um projeto experimental de sobrevivência vs. terminal. Capitalizando a potência sinergística de uma combinação de anestésicos múltiplos de diferentes classes de fármacos5,14 e paraléticos1,6 para diminuir a dose de agentes individuais5 ou administrar uma dose de baixa manutenção após uma dose de indução mais elevada são estratégias típicas. No entanto, apesar de suas conhecidas toxicidades cardiorrespiratórias, incluindo a morte8, a tricaína ainda é a mais utilizada, a melhor disponível, e a única anestésica aprovada pela administração de alimentos e drogas dos EUA (FDA) para zebrafish Anestesia. Tricaína tem sido popularmente utilizado na gravação de ECG de zebrafish adulto, quer como um único agente ou em combinação com outros anestésicos ou paraléticos.
Em segundo lugar, a exatidão da colocação da ligação pode ser assegurada pelo menos para o zebrafish normal saudável usando nossos quatro critérios de validação para um ECG adulto normal do zebrafish. Dos quatro critérios de validação que propomos aqui, os dois últimos critérios juntos confirmam a concordância fundamental entre a polaridade da onda R e a da onda T em um ECG normal5,7,15. Esta concordância da onda R e T é uma semelhança fortuita, porém crítica, entre o zebrafish e o humano16,17 ECG normal que contribui para a relevância clínica do modelo do coração de zebrafish como um substituto para o cardíaco humano Eletrofisiologia. No entanto, várias condições benignas ou malignas podem invalidar qualquer um dos quatro critérios de validação. Por exemplo, a concordância da onda R e T é perdida na isquemia miocárdica7,15. Essa perda da concordância da onda R e T na isquemia miocárdica é outra semelhança marcante entre o zebrafish e o ECG humano que contribui para a relevância clínica do modelo de infarto do miocárdio zebrafish.
Por fim, recomendamos uma prática padrão na análise de ECG. Com o advento da tecnologia, o software da análise de ECG pode gerar a interpretação automática de ECG. Entretanto, nós recomendamos fortemente que os seres humanos treinados devem sempre reinterpretar e verificar todos os ECGs baseados no scenario clínico respectivo que conduz à gravação de ECG. A dependência excessiva da rotina unicamente na interpretação automática por um software da análise de ECG é desaconselhável, particular na presença de variações normais comuns de ECG, de patologias cardíacas, ou de colocação suboptimal da ligação.
Este estudo centra-se no método minimamente invasivo para sessões breves de gravação de ECG. No entanto, deve surgir a necessidade de sessões de registro de ECG prolongadas por horas duradouras, modificações são necessárias para fornecer oxigenação, hidratação e anestesia adequadas por perfusão contínua6.
Adicionalmente, realce a relação sinal-ruído por um de pelo menos três maneiras. Escolher um amplificador mais potente é muitas vezes uma opção dispendiosa, se não impraticável. Abrir o saco pericárdico para reduzir o volume condutor é uma abordagem razoável, embora invasiva, que foi adotada7. A colocação estratégica da ligação para alinhar o eixo da ligação em um sentido paralelo ao eixo cardíaco principal (Figura 4B) maximizará os sinais da tensão de ECG mas pode exigir o teste e o erro, especial na ausência de pericardiotomy.
O método de interrogação in vivo de ECG para zebrafish adulto que apresentamos aqui oferece quatro vantagens principais. Primeiramente, nossa aproximação minimamente invasora exige somente a inserção do elétrodo, mas nenhuma remoção da escala de peixes ou thoracotomy-pericardiotomy. Conseqüentemente, minimizando a dor para os peixes, nossa aproximação permite interrogatórios repetidos de ECG em estudos longitudinais da sobrevivência. Em segundo lugar, quando os anestésicos suprimem adequadamente o movimento dos peixes, o sistema de gravação in vivo de ECG em nosso estudo produz consistentemente uma relação sinal-ruído satisfatória com sinais brutos sem ruído. Em terceiro lugar, a validação de qualidade de quatro critérios que propomos aqui assegura a exatidão e robustez dos dados no início da aquisição de dados do ECG e minimiza as variações dependentes do operador. Por fim, em particular, nosso último critério de validação (a onda T normal é ereto) encapsula a concordância da onda R e da onda T, uma característica humana-semelhante importante do ECG normal de zebrafish (Figura 1).
No entanto, ainda existem quatro grandes limitações para a atual metodologia de ECG in vivo para o zebrafish adulto por nosso grupo e outros.
Em primeiro lugar, a falta de cooperação do sujeito requer a necessidade de anestesia com suas conseqüências de toxicidade cardiorrespiratória limitante. Para a interrogação de ECG in vivo, enquanto os pacientes humanos nunca necessitam de sedação, o zebrafish sempre requer anestésicos ou paraléticos, os quais causam toxicidades cardiorrespiratórias variáveis.
Em segundo, a necessidade de fixar o ECG Unido conduz ligeiramente eleva a invasividade de um procedimento de outra maneira não-invasor. Considerando que a colocação da ligação na gravação de ECG do corpo-superfície dos seres humanos é inteiramente não-invasora porque os elétrodos aderem à epiderme humana, colocação da ligação para a gravação in vivo de ECG do zebrafish são mais invasoras porque, no mínimo, os elétrodos de aço devem perfure a pele dos peixes para a inserção segura na musculatura dos peixes.
As duas últimas limitações decorrem das restrições anatômicas do peito e do coração de zebrafish. Em terceiro lugar, o tamanho minúsculo do coração adulto do zebrafish necessita uma redução drástica no número de ligações de ECG. Quando os seres humanos acomodem prontamente doze ligações em uma gravação padrão de ECG, o zebrafish adulto pode tipicamente acomodar somente uma única ligação unipolar ou bipolar. O ramificação de uma única ligação de ECG é o desafio para aperfeiçoar simultaneamente as amplitudes de todas as três ondas de P, de R, e de T. Daqui, a importância da colocação óptima e exata da ligação na interrogação de ECG do zebrafish não pode ser exagerada. Em zebrafish, a onda T apresenta um desafio de detecção único, porque muitas vezes é a menor dessas três ondas. Conseqüentemente, a amplitude da onda de zebrafish T deve receber a prioridade da optimização sobre as ondas tipicamente maiores do P e do R.
Em quarto lugar, determinar o principal eixo cardíaco do zebrafish para maximizar a amplitude da onda R pode ser desafiador. A razão é que o coração do zebrafish tem mais liberdade de movimento dentro de seu saco pericárdico frouxo comparado ao coração humano dentro de seu formulário-encaixe luva-como o pericárdio.
Globalmente, essas limitações estimularão a inovação do método futuro. Com o advento da impressão 3D e da eletrônica deformável18, há esperança para a implantação direta de chumbo um dia em acordado, alerta, natação zebrafish usando uma ‘ meia cardíaca ‘ de sensores de eletrodo sem fio.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde R01 HL141452 para a TPN. A ADInstruments gentilmente forneceu financiamento generoso para financiar o custo da publicação de acesso aberto, mas não teve nenhum papel no desenho experimental, aquisição de dados, análise de dados deste estudo ou qualquer acesso ao manuscrito antes da publicação.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |