特定神经元种群与圆虫卡埃纳哈布迪炎的分离
Summary
在这里,我们提出了一个方案,用于简单分离特定组活神经元细胞表达绿色荧光蛋白从转基因开诺哈布迪炎叶兰根线。这种方法使各种外体研究侧重于特定的神经元,并有能力分离细胞,以进一步的短期培养。
Abstract
在衰老过程中,许多细胞积累高水平的损伤,导致细胞功能障碍,这是许多老年病和病理状况的基础。后线神经元代表受老化影响的主要细胞类型。虽然神经元老化的多种哺乳动物模型存在,但它们具有挑战性,而且建立成本高昂。类虫Caenorhabdiselegans是研究神经元老化的有力模型,因为这些动物的寿命短,有一个健壮的基因工具箱,并且有良好的目录神经系统。本文介绍的方法允许根据转基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达对特定细胞进行无缝分离。在独特的细胞类型特异性启动子下表达GFP的转基因动物系被消化,以去除外角质,并轻轻机械地中断,产生含有各种细胞类型的浆料。然后,通过荧光激活细胞分类或抗GFP耦合磁珠将感兴趣的细胞从非目标细胞中分离出来。然后,分离的细胞可以在有限的时间内培养,或立即用于细胞特异性的体外分析,如实时定量PCR的转录分析。因此,该协议允许快速和可靠的分析细胞特异性反应在不同的神经元群体在C.elegans。
Introduction
在过去的几十年里,元动物模型生物Caenorhabdiselegans在研究神经元、神经元回路及其在生理和行为反应中的作用以及衰老相关的神经退行性方面一直是一个巨大的财富。疾病。C.elegans的一个独特特征是动物是透明的,允许绘制所有成年体细胞的谱系。C. elegans也含有可管理的神经元数量,导致神经系统的形态和连接性被很好地理解2。不变的细胞谱系、短寿命和丰富的高通量遗传工具可用于C.elegans,使其成为研究不同神经元种群中衰老的理想模型生物体。
神经元老化和神经退行性障碍是复杂的,每种疾病都有与之相关的独特的病理特征。然而,对于许多这些疾病,如帕金森氏症和阿尔茨海默氏症,一个常见的特征是错误折叠的蛋白质3,4,5的逐渐加载。在这两种疾病中,蛋白质在细胞内失折叠和聚集引起毒性,最终导致细胞死亡4,5。对于神经元的适当老化,线粒体的平衡,更具体地说,蛋白质平衡,是重要的,因为扰动和失地症可能导致神经退化6,7,8。细胞具有维持蛋白质平衡的各种机制,一种是展开的蛋白质反应(UPR)——一种经典途径,其中来自内质神经质(ER)的信号激活细胞内信号级联,导致转录响应9.与这个普世自来的ER类似,元群对线粒体蛋白平衡的丧失表现出类似的反应,即所谓的线粒体UPR(UPR mt)7、8。C. elegans似乎是最基础的有机体,有一个确认和明确定义的普天并乐通路7。
由于特定神经元群的内在连通性和复杂性3,因此很难评估较大网络中特定神经元群体的功能/功能。然而,由于细胞类型特异性疾病与复杂的病理,如那些与细胞蛋白质平衡受损相关的疾病,通常需要研究不同的神经元群体。在C.elegans中,特定的神经元群体可以进行基因操纵,从而在体内进行简单的观察。C. elegans的神经系统主要由神经元组成,其中胶质细胞的一小部分。在成年的赫马普罗狄特蠕虫中,大约有302个神经元,细分为100多个不同的类2,10。神经元,如胆碱能神经元在神经肌肉结中占主导地位,而多巴胺能神经元主要参与感觉10,11。随着运动活动和感觉能力随着年龄的增长而下降,详细阐述这些个体神经元缺陷的机械性见解非常重要。因此,需要一种简单而可靠的方法来分离感兴趣的完整细胞,以便进行后续的活体研究。
在这里,我们描述了一种优化的有效方法,用于快速分离表达绿色荧光蛋白(GFP)的特定神经元细胞。这种隔离方法可以对幼虫、幼虫或成年蠕虫执行。从幼虫中分离细胞之前,张等人曾发表于13,这里不讨论。这里很重要的一点就是,所有的蠕虫都需要处于同一生命阶段,以防止动物过度消化或受到不同生命阶段动物的污染。通过酶和机械破坏线虫角质层,外骨骼高胶原蛋白和其他结构蛋白质,各种各样的细胞可以分离13,14。然后,细胞可以通过流式细胞测定或抗体标记磁珠进行分离。通常,RNA通过苯酚和瓜尼丁等子黄酸酯法分离,以确保所需细胞群15的富集。非常小心,这些孤立的细胞可以保存在培养瓶或多井盘中。该方法代表了研究特定神经元的独特而强大的工具,具有分离活细胞和功能细胞的能力,以便进一步培养。
Protocol
Representative Results
Discussion
圆虫C.elegans是研究神经元健康和疾病2的成熟和强大的模型。随着足够的基因工具来操纵这些动物和可管理的数量精确映射的各种神经元类型,大量的数据可以收集与相对较少的材料量。在这里,我们概述了一个优化的方法,从整个动物分离不同的神经元。通过破坏蠕虫的外角质蛋白,可以分离出各种细胞类型的浆料,包括神经元和肌肉细胞5。这些分离的细胞可…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢詹妮弗·福克斯博士和哈利蒙丘克实验室的成员有见地的评论。我们感谢国家卫生研究院(R01 GM108975 至 O.K. 和 T32 GM107001-01A1 到 E.M.G.)的支持。
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
Riferimenti
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia dello sviluppo. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
