둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리
Summary
여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.
Abstract
노화 과정 동안, 많은 세포는 많은 노인 및 병리 조건의 기초가 세포 기능 장애로 이어지는 손상의 높은 수준을 축적. 유사 분열 후 뉴런은 노화에 의해 영향을받는 주요 세포 유형을 나타냅니다. 뉴런 노화의 여러 포유류 모델이 존재하지만, 그들은 확립하기 어렵고 비용이 많이 듭니다. 둥근 벌레 예쁜꼬마선충은 이 동물들이 짧은 수명, 사용 가능한 강력한 유전 도구 상자 및 잘 분류된 신경계를 가지고 있기 때문에 신경 노화를 연구하는 강력한 모델입니다. 본원에 제시된 방법은 형질전환 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현에 기초하여 특정 세포의 원활한 분리를 허용한다. GFP를 발현하는 형질전환 동물 라인은 뚜렷한 세포 유형 특이적 프로모터로 소화되어 외부 표피를 제거하고 기계적으로 기계적으로 다양한 세포 유형을 함유하는 슬러리를 생성하도록 중단된다. 관심있는 세포는 형광 활성화 세포 선별을 통해 비 표적 세포로부터 분리되거나 반대로 GFP 결합 된 자기 구슬에 의해 분리됩니다. 단리된 세포는 제한된 시간 동안 배양되거나 실시간 정량적 PCR에 의한 전사 분석과 같은 세포 특이적 생체 분석에 즉시 사용될 수 있다. 따라서, 이 프로토콜은 C. elegans에있는 다른 신경 인구 내의 세포 특정 반응의 신속하고 강력한 분석을 허용합니다.
Introduction
지난 수십 년 동안, 메타조안 모델 유기체 인 Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 뉴런, 신경 회로 및 생리 및 행동 반응에서의 역할 및 노화 관련 신경 퇴행성 연구에 엄청난 자산이었습니다. 질병. C. elegans의 유일한 특징은 동물이 투명하다는 것입니다, 모든 성인 체세포의 혈통이매핑될 수 있도록 1. C. 예쁜꼬마선충은 또한 신경의 관리 가능한 양을 항구, 잘 이해되는 신경계의 형태와 연결로 이끌어 내는2. 불변 세포 혈통, 짧은 수명, 그리고 C. elegans에 사용할 수 있는 높은 처리량 유전 도구의 풍부는 다른 신경 인구 내의 노화의 연구를 위한 이상적인 모형 유기체합니다.
뉴런과 신경 퇴행성 질환의 노화는 복잡하며 각 장애에는 독특한 병리학 적 서명이 있습니다. 그러나, 파킨슨병및 알츠하이머병과 같은 이러한 장애의 많은 경우, 일반적인 특징은 잘못 접힌단백질의 점진적 하중3,4,5이다. 이 두 질병 에서, 단백질잘못 접고 세포 내에서 집합 독성을 일으킬,궁극적으로 세포 죽음으로 이어지는 4,5. 뉴런의 적절한 노화를 위해, 미토콘드리아의 항상성, 보다 구체적으로 는 단백질 항상성, 관동 및 dyshomeostasis신경변성으로 이어질 수 있기 때문에, 중요하다 6,7,8. 세포는 단백질 항상성을 유지하기 위해 다양한 메커니즘을 갖추고 있습니다, 하나는 전개 된 단백질 반응 (UPR)-세포 내 망상 (ER)에서 신호가 세포 내 신호 캐스케이드를 활성화하는 고전적인 통로인, 전사로 이끌어 냅니다 응답9. 이러한 UPRER과유사하게, 메타조안은 미토콘드리아 단백질 항상성의 손실에 유사한 반응을 나타내며, 소위 미토콘드리아 UPR(UPR mt)7,8. C. 예쁜꼬마선충은 확인되고 잘 정의된 UPRmt 통로7을가지는 가장 기초유기체인 것으로 보인다.
더 큰 네트워크 내의 특정 뉴런 집단의 기능/기능 장애는 본질적인 연결성과 복잡성으로 인해 평가하기 어려울 수 있습니다3. 그러나, 수시로 손상된 세포 단백질 항상성과 관련되었던 것과 같은 복잡한 병리학을 가진 세포 모형 특정 질병 때문에 명백한 신경 인구를 공부하는 필요가 있습니다. C. 예쁜꼬마선충에서,특정 신경 인구는 생체 내에서 허구 관찰을 허용하는 유전으로 조작될 수 있습니다. C. elegans의 신경계는 주로 신경교세포의 작은 비율로 뉴런으로 구성됩니다. 성인 헤르마로디테 웜에는 약 302개의 뉴런이 있으며, 100개이상의 서로 다른 클래스 2,10으로세분화되어 있다. 해 신경 세포와 같은 뉴런은 신경 근육 접합부에서 우세한 반면, 도파민성 뉴런은 주로 감각10,11에관여합니다. 운동 활동과 감각 능력이 나이가 들면서 감소함에 따라, 이러한 개별 뉴런의 결함에 대한 기계적 통찰력을 자세히 설명하는 것이 중요합니다11,12. 이와 같이, 후속 생체 내 연구에 대한 관심 있는 세포를 온전한 세포를 분리하는 간단하고 강력한 방법에 대한 필요성이 있다.
여기서, 우리는 C. elegans에서 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 특정 신경 세포의 신속한 격리를위한 최적화 된 효과적인 방법을 설명합니다. 이 격리 방법은 애벌레, 청소년 또는 성인 웜에서 수행 할 수 있습니다. 애벌레 벌레로부터 세포의 격리는 이전에 장 외13에 의해 간행되었으며 여기에서 논의되지 않을 것이다. 여기서 중요한 참고는 모든 벌레가 다른 삶의 단계에서 동물의 과잉 소화 또는 오염을 방지하기 위해 동일한 삶의 단계에 있어야한다는 것입니다. 선충 표피의 효소 및 기계적 중단을 통해, 콜라겐 및 기타 구조 단백질이 높은 외골격, 다양한 세포를13,14로분리할 수 있다. 세포는 그 때 유동 세포 측정 또는 자기 비드표지된 항체를 통해 분리될 수 있습니다. 전형적으로, RNA는 원하는 세포 집단(15)의 농축을 보장하기 위해 페놀 및구아니딘 이소티오차네이트 방법을 통해 단리된다. 많은 주의를 기울여 이러한 단리된 세포는 배양 플라스크 또는 다중 웰 접시에서 유지될 수 있다. 이 방법은 특정 뉴런의 연구에서 독특하고 강력한 도구를 나타내며 추가 배양을 위해 살아있는 세포와 기능성 세포를 분리할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
둥근 벌레 C. 예쁜 꼬마는 신경 건강과 질병을 연구하는 잘 설립되고 강력한 모델입니다2. 이러한 동물을 조작할 수 있는 충분한 유전 적 도구와 정확하게 매핑 된 다양한 뉴런 유형의 관리 가능한 양을 사용하면 비교적 적은 양의 재료로 많은 양의 데이터를 수집 할 수 있습니다. 여기서는 전체 동물로부터 뚜렷한 뉴런을 분리하는 최적화된 방법을 설명합니다. 벌레의 외?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 제니퍼 폭스 박사와 칼리몬축 연구소의 회원들에게 통찰력있는 의견에 감사드립니다. 우리는 건강의 국가 학회에서 지원을 인정 (R01 GM108975 O.K.와 T32 GM107001-01A1 E.M.G.에).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
Riferimenti
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