Roundworm Caenorhabditis elegans belirli neuron nüfus yalıtım
Summary
Burada, biz transgenik Caenorhabditis elegans hatları yeşil floresan protein ifade canlı nöronal hücrelerin belirli grupların basit yalıtım için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, belirli nöronlara odaklanan ex vivo çalışmaların çeşitli sağlar ve daha kısa vadeli kültür için hücreleri yalıtmak için kapasitesine sahiptir.
Abstract
Yaşlanma sürecinde, birçok hücre, birçok geriatrik ve patolojik koşula karşı gelen hücresel fonksiyon bozukluğu olan yüksek hasar düzeylerini birikir. Post-mitotik nöronlar yaşlanma tarafından etkilenen büyük bir hücre türünü temsil eder. Nöronal yaşlanma birden fazla memeliyen modelleri var olsa da, onlar zorlu ve kurmak için pahalıdır. Yuvarlak kurt Caenorhabditis elegans nöronal yaşlanma çalışması için güçlü bir modeldir, bu hayvanların kısa ömürlü olduğu gibi, mevcut sağlam genetik araç, ve iyi kataloglanmış sinir sistemi. Burada sunulan yöntem, transjenik yeşil floresan proteinin (GFP) ifadesine dayalı olarak belirli hücrelerin kesintisiz yalıtımına olanak sağlar. Farklı altında Gfp ifade transgenik hayvan hatları, hücre tipine özgü promotörler dış manikür kaldırmak için sindirilmiş ve hafifçe mekanik çeşitli hücre türleri içeren bulamaç üretmek için kesintiye uğrattı. Daha sonra ilgi hücreleri floresans aktif hücre sıralama yoluyla hedef olmayan hücrelerden ayrılır, veya anti-GFP-bağlantılı manyetik boncuklar tarafından. Yalıtılmış hücreler daha sonra sınırlı bir süre için kültürlü olabilir veya hemen gerçek zamanlı nicel PCR tarafından transkripsiyon analizi gibi hücreye özgü ex vivo analizler için kullanılır. Böylece, bu protokol C. elegansfarklı nöronal nüfus içinde hücreye özgü tepkiler hızlı ve sağlam analizi için izin verir.
Introduction
Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, Metazoan model organizma Caenorhabditis elegans nöronlar, nöronal devre ve fizyolojik ve davranışsal tepkiler rol ve yaşlanma ilişkili nörodejeneratif çalışmada muazzam bir varlık olmuştur Hastalık. C. elegans benzersiz bir özelliği hayvanların şeffaf olduğunu, tüm yetişkin somatik hücrelerin soy için izin eşleştirilir1. C. elegans da sinir sisteminin Morfoloji ve bağlantı yol açan nöronların yönetilebilir miktar liman iyi2anlaşılabilir. Sabit hücre soyluğu, kısa ömrü ve C. elegans için mevcut yüksek verimlilik genetik araçların bolluk farklı nöronal nüfus içinde yaşlanma çalışması için ideal bir model organizma olun.
Nöronların yaşlanma ve nörodejeneratif bozukluklar karmaşıktır, ve her bozukluk ile ilişkili benzersiz patolojik imzaları vardır. Ancak, Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi bu bozuklukların birçoğu için, ortak bir özellik, yanlış katlanan proteinlerin Progressive yükü3,4,5. Bu hastalıkların her ikisi de, proteinlerin hücre içinde toksisite neden, sonuçta hücre ölümü4,5yol açan ve toplu. Nöronların uygun yaşlanma için, mitokondri homeostaz, daha spesifik protein homeostaz, önemlidir, gibi perturbations ve dyshomeostasis nörodejenerasyon6,7,8yol açabilir. Hücreler protein homeostazı korumak için çeşitli mekanizmalar ile donatılmıştır, bir biri olmayan protein tepkisi (UPR) ― endoplazmik retikulum sinyalleri (er) hücre içi sinyal Cascades etkinleştirmek klasik bir yol, bir transkripsiyonel yol Yanıt9. Bu UPReriçin, metazoanlar mitokondrial protein homeostasis kaybına benzer bir yanıt görüntüler, sözde mitokondriyal UPR (UPRMT)7,8. C. elegans bir teyit ve iyi tanımlı UPRMT yolu7için en bazal organizma gibi görünüyor.
Daha büyük bir ağ içinde belirli nöronal nüfus fonksiyon/disfonksiyon kendi içsel bağlantı ve karmaşıklık nedeniyle değerlendirmek zor olabilir3. Ancak, genellikle karmaşık patolojiler ile hücre türüne özgü hastalıklar nedeniyle farklı nöronal nüfus çalışması için bir ihtiyaç vardır, gibi bozulmuş hücresel protein homeostaz ile ilişkili olanlar gibi. C. elegans, spesifik nöronal nüfus genetiği izlenmesine izin in vivo olarak manipüle edilebilir. C. elegans sinir sistemi öncelikle nöronlar oluşur, glial hücrelerin küçük bir yüzdesi ile. Yetişkin hermafrodit solucanlarında, yaklaşık 100 farklı sınıflar2,10bölünür 302 nöronlar vardır. Nöromüsküler kavşakların içinde kolinerjik nöronlar gibi nöronlar, dopaminerjik nöronlar öncelikle Sensation10,11‘ de yer almakta. Hem motor aktivitesi hem de duyusal yetenekler yaş ile düşüş olarak, bu bireysel nöronlar üzerinde kusurları hakkında mekanik Öngörüler ayrıntı önemlidir11,12. Bu nedenle, sonraki ex vivo çalışmalarda ilgi bozulmamış hücreleri yalıtmak için basit ve sağlam bir yöntem için bir ihtiyaç vardır.
Burada, C. eleganlar ‘dan yeşil floresan proteini (Gfp) ifade eden belirli nöronal hücrelerin hızlı yalıtımı için optimize edilmiş etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yalıtım yöntemi larval, juvenil veya erişkin solucanlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Larva solucanlardan hücrelerin izolasyonu daha önce Zhang ve al.13 tarafından yayınlandı ve burada tartışılmaz. Burada önemli bir Not Tüm solucanlar hayvan veya farklı yaşam aşamalarında hayvanların kontaminasyonu aşırı sindirimi önlemek için aynı yaşam aşamasında olması gerekir. Nematod manikür hem enzimatik ve mekanik bozulma ile, kollajen ve diğer yapısal proteinler yüksek bir dış iskelet, hücreler çok çeşitli yalıtılmış olabilir13,14. Hücreler sonra akış sitometri veya antikor etiketli manyetik boncuk ile izole edilebilir. Genellikle, RNA, istenilen hücre popülasyonunun zenginleştirilmesi için bir fenol ve guanidin isothiocyanate yöntemi ile izole edilir15. Çok bakım ile bu izole hücreler bir kültür Flask veya çok iyi yemek muhafaza edilebilir. Bu yöntem, spesifik nöronların çalışmasında benzersiz ve güçlü bir aracı temsil eder ve daha fazla kültür için canlı ve fonksiyonel hücreleri izole etme kapasitesine sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yuvarlak kurt C. elegans nöronal sağlık ve hastalık2çalışma için iyi kurulmuş ve güçlü bir modeldir. Bu hayvanları manipüle etmek için geniş genetik araçlarla ve tam eşleştirilen çeşitli nöron türlerinin yönetilebilir miktarını, nispeten az miktarda malzeme ile büyük bir veri toplanabilir. Burada, tüm hayvanlardan farklı nöronları izole etmek için optimize edilmiş bir yöntem özetlemektedir. Solucanın dış manikür proteinleri bozarak, çeşitli hücre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Jennifer Fox ve anlayışlı Yorumlar için Khalimonchuk Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Biz Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM108975 için ok ve T32 GM107001-01A1 için E.M.G.) destek kabul ediyoruz.
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
Riferimenti
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia dello sviluppo. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
